酶的結(jié)構(gòu)與功能

1、第二章 酶的結(jié)構(gòu)與功能,Enzyme,主要內(nèi)容主要介紹酶的概念、催化特性及其化學(xué)本質(zhì)，討論酶的結(jié)構(gòu)特征和催化功能以及酶的作用機(jī)理，進(jìn)而討論影響酶作用的主要因素。,重 點酶促反應(yīng)動力學(xué)（影響酶反應(yīng)的因素）；酶的作用機(jī)理,難 點激活劑、抑制劑的影響；別構(gòu)調(diào)節(jié),酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史,人們對酶的認(rèn)識起源于生產(chǎn)與生活實踐。夏禹時代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國時期已知用麴(曲)治療

2、消化不良的疾病。酶者，酒母也,第一節(jié) 酶引論,enzyme ("in yeast"),enzyme是希臘文 en = in ， zyme = yeast,,什么是酶？,酶是生物催化劑生物體一切生化反應(yīng)都需酶催化才能進(jìn)行！性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人造催化劑定義：由活細(xì)胞產(chǎn)生的、 有高度專一性和 高效催化作用的生物大分子。,,一、酶是生物催化劑,1.只能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)； 2.提高反應(yīng)速度，不

3、改變平衡點; 3. 只起催化作用，本身不消耗； 4. 降低反應(yīng)的活化能。,（一）與一般催化劑相同的特點,,,,,,,,,,,,,,,一般催化劑反應(yīng)活化能,反應(yīng)總能量變化,酶促反應(yīng)活化能,非催化反應(yīng)活化能,初 態(tài),終 態(tài),能 量 改 變,活 化 過 程,酶促反應(yīng)活化能的改變,過渡態(tài),活化能(activation energy) 指在一定溫度下，1mol底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能

4、單位：KJ/mol,酶催化反應(yīng)的實質(zhì)：,降低反應(yīng)的活化能,1. 高效性,且無副反應(yīng),反應(yīng)速度是無酶催化/普通人造催化劑催化反應(yīng)速度的105——1017倍。,（二） 生物催化劑的特點,鐵屑 肝糜 肝糜(煮),例：雙氧水裂解,2.專一性,Specificity: 酶對催化的反應(yīng)和反應(yīng)物有 嚴(yán)格的選擇性。,底物（substrate): 酶作用的物質(zhì)。,（1）酶濃度的可調(diào)性

5、 （2）通過激素調(diào)節(jié)酶活性 （3）反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性 （4）抑制劑和激活劑 （5）別構(gòu)調(diào)控、共價修飾、同工酶等,3. 可調(diào)節(jié)性,為P所抑制 A ―‖→ B → C → D → P（終產(chǎn)物） ↑… … … … … … … …↑圖 通過終產(chǎn)物可逆的結(jié)合對途徑中的第1個酶反饋抑制,4.反應(yīng)條件溫和（易失活）,常溫、常壓、中性,5.催

6、化活性與結(jié)構(gòu)有關(guān),生物固氮：,工業(yè)氨合成：,二、酶的化學(xué)本質(zhì)及組成,①經(jīng)酸堿水解終產(chǎn)物是AA②能被蛋白酶水解而失活③酶可變性失活④酶是兩性電解質(zhì)⑤具有不能通過半透膜等膠體性質(zhì)⑥具有蛋白質(zhì)的化學(xué)呈色反應(yīng),化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),（一）酶的化學(xué)本質(zhì),,,1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。,1995年，Jack W. Szostak 研究室首先報道

7、了具有DNA連接酶活性的DNA片段，稱之為脫氧核酶(deoxyribozyme)，為生物催化劑的發(fā)展作出了新的貢獻(xiàn)。,單純酶 ：只有蛋白質(zhì)綴合酶（結(jié)合酶）：脫輔酶 + 輔助因子,輔助因子,輔基（prosthetic group）,輔酶（coenzyme）,{,與酶結(jié)合緊,與酶結(jié)合松,,全酶,（二）酶的化學(xué)組成,根據(jù)酶的組成成份：,羧肽酶,,綴合酶中： 單獨酶蛋白或輔助因子沒有催化活性一種酶蛋白一般只與一種輔助因子結(jié)合同種

8、輔助因子可與不同的酶蛋白結(jié)合,,酶蛋白：決定反應(yīng)的專一性輔助因子：傳遞電子、原子或某些 化學(xué)基團(tuán)的作用,monomeric enzyme：一般由一條肽鏈組成oligomeric enzyme：為寡聚蛋白，≥2個亞基multienzyme complex：幾種酶靠非共價鍵 彼此嵌合而成。－－酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng), 有利于提高酶的催化效率并便于對酶的調(diào)控。 （如糖代謝、脂代謝）,,（三）單

9、體酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體,根據(jù)酶蛋白分子的特點：,三、酶的命名和分類,（一）習(xí)慣命名法,根據(jù)其催化底物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個原則來命名，有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。,（略講）,優(yōu)點 　命名簡單　　　　　　應(yīng)用歷史較長，使用方便缺點　　　一名數(shù)酶、一酶數(shù)名為了適應(yīng)酶學(xué)發(fā)展的新情況，國際酶學(xué)會議于1961年提出一個新的系統(tǒng)命名法及分類原則，已被國際生化協(xié)會采用。,（二）國際系統(tǒng)命

10、名法：,系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。,底物1 ：底物2 + 反應(yīng)性質(zhì)+酶,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,,乳酸：NAD+氧化還原酶,當(dāng)?shù)孜餅樗畷r，可省略,系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。,慣用名：只取較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。,對于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。,（三）國際系統(tǒng)分類編號,1961年國際酶學(xué)委員會（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)

11、類型和機(jī)理，把酶分成6大類：,氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)，催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。,1、氧化還原酶 Oxidoreductase,（四）六大類酶的特征,（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng),（2）氧化酶類,①催化底物脫氫，氧化生成H2O2：,②催化底物脫氫，氧化生成H2O：,（3）過氧化物酶,（4）

12、加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）,轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。根據(jù)X分類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。,2、轉(zhuǎn)移酶 Transferase,水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：,3、水解酶 hydrolase,裂合酶催化

13、從底物分子中移去一個基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。,4、裂合酶 Lyase,異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng),5、異構(gòu)酶 Isomerase,P,P,合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。例如，丙酮酸

14、羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 ? 草酰乙酸,6、合成酶 Ligase or Synthetase,酶的系統(tǒng)編號：4位數(shù)字第一位：代表六大類反應(yīng)類型第二位：亞類（作用的基團(tuán)或鍵的特點）第三位：亞亞類（精確表示底物/產(chǎn)物的性質(zhì)）第四位：在亞亞類中的序號,——指酶對底物的選擇性，也稱特異性。,結(jié)構(gòu)專一性,立體專一性,,絕對專一性,相對專一性,,基團(tuán)專一性,鍵專一性,,旋光異構(gòu)專一性（D-、L-）,幾何異構(gòu)專一性

15、(順、反異構(gòu)),四、酶的專一性,（一）酶的專一性,基團(tuán)專一性,胰蛋白酶,（1）鎖鑰學(xué)說——剛性構(gòu)象（2）誘導(dǎo)契合學(xué)說（3）三點附著學(xué)說 ——立體異構(gòu)專一性的酶,（二）與酶專一性有關(guān)的學(xué)說,鎖鑰學(xué)說,認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣,“三點結(jié)合”的催化理論,酶與底物的結(jié)合處至少有三個點，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對稱催

16、化作用才能實現(xiàn)。,誘導(dǎo)契合學(xué)說,酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補形狀.,（Koshland，1958）：當(dāng)?shù)孜锖兔附佑|時，可誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象變化，使酶活性中心的各種基團(tuán)處于和底物互補契合的正確空間位置，有利于催化。,（三）研究酶的專一性的意義,理論上，專一性－－弱鍵和結(jié)構(gòu)互補成為理解生物大分子之間相互作用的基石。 實踐上也有重要意義。例如，某藥物具有某一種構(gòu)型才有生理效用，而有機(jī)合成的是

17、消旋混合物, 若用酶可以進(jìn)行不對稱合成或不對稱拆分,即得到單一構(gòu)型的藥物。,五、酶的活力測定和分離純化,（一） 酶活力與酶促反應(yīng)速度,1、酶活力（enzyme activity）,酶活力就是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力?？梢杂盟呋骋换瘜W(xué)反應(yīng)的速度來表示。,酶活力的大小代表酶的量,2.活力單位 (U),酶單位（U）： 在一定條件下、一定時間內(nèi)、將一定量的 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。如： 每小時催化1克底物

18、 每小時催化1ml某濃度溶液 每分鐘催化1ug底物,一定時間,一定量底物,一定條件下,在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ℃ ，最適pH和最適底物濃度）一分鐘內(nèi)催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 IU= 1 ?mol / min ——酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化,（1）國際單位（IU）,在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ℃ ，最適pH和最適底物濃度）每秒鐘催化1摩爾底物

19、轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60×106 IU = 6×107 IU 1IU =（1/60）μKat = 16.7nKat ——酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化,（2）Kat,每mg酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)。 U/mg酶蛋白、 U/ml酶蛋白酶產(chǎn)品質(zhì)量評價中常使用，一定程度上代表酶的純度。,（3）比活力 (s

20、pecific activity),比活力越大，酶的純度越高,一定條件下：每秒鐘、每個酶分子轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)或每微摩爾酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)一秒內(nèi)1摩爾的酶可催化幾摩爾的底物,（4）轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number，TN）,——反應(yīng)酶的催化活性中心的活性,用哪一個速度來表示酶促反應(yīng)的速度特征呢？,,反應(yīng)初速度 Vo,逐漸降低,酶反應(yīng)進(jìn)程曲線,在酶促反應(yīng)開始無任何干擾因素出現(xiàn)時, 短時間內(nèi)酶的反應(yīng)速度。一般指反應(yīng)底物消耗5

21、%以內(nèi)時的反應(yīng)速率 。,3. 酶促反應(yīng)速度,單位時間內(nèi)底物(S)的減少量或產(chǎn)物(P)的增加量,Why?,反應(yīng)速度逐漸降低的原因：①底物濃度的降低； ② 產(chǎn)物的生成逐漸增大了逆反應(yīng)； ③酶在反應(yīng)中失活； ④ 產(chǎn)物對酶的抑制,反應(yīng)初速度表示酶活力,（二）酶活力的測定——酶反應(yīng)速度的測量,測量單位時間內(nèi)底物的消耗量。測量單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。,濃度,時間,,產(chǎn)物P,反應(yīng)物S,（1）應(yīng)測反應(yīng)初速度（initial velocity）

22、 底物濃度變化在起始濃度5%以內(nèi)。,（2）酶的反應(yīng)速度一般用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增 加量來表示。,（3）測酶活力時應(yīng)使反應(yīng)溫度、pH、離子強(qiáng)度和底物濃度等因素保持恒定。,（4）測定酶反應(yīng)速度時，應(yīng)使[S]>>[E]。,1、測定酶活力的注意事項,2、 酶活力的測定方法,（1）分光光度法（spectrophotometry）,該法要求酶的底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部分光吸收不同。,優(yōu)點：簡便、迅速、準(zhǔn)確；一個樣品可多次測定；可檢測

23、到10-9mol/L水平的變化。,例: 人血清乳酸脫氫酶活力的測定,（2）熒光法（fluorometry）,該法要求酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有熒光變化。,主要的優(yōu)點：靈敏度很高，可測10-12mol/L的樣品。,酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe殘基以及一些輔酶、輔基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能發(fā)出熒光。,（3）酶偶聯(lián)分析法(enzyme coupling assay),第一個酶的產(chǎn)物為第二個酶的底物，這兩個酶系統(tǒng)在一起

24、反應(yīng)。,P1無光吸收或熒光變化，偶聯(lián)后, P2有光吸收或熒光變化。,例：測己糖激酶的活性,（4）電化學(xué)法（electrochemical method）,——有pH測定法、離子選擇性電極法等。,離子選擇性電極法要求在酶反應(yīng)中必須伴隨有離子濃度的變化或氣體的變化（如O2、CO2、NH3等）。,例: 葡萄糖氧化酶活性的測定,（5）同位素法,放射性同位素標(biāo)記底物，經(jīng)酶作用得到相應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)適當(dāng)分離，測定產(chǎn)物脈沖數(shù)即可。,酶活力測定實例,①確定

25、反應(yīng)條件 20℃、pH=7，底物濃度 6g/l（過量）， 加入2mg固體脂肪酶②確定活力單位 每小時催化1克底物 1u= 1g/h③ 測反應(yīng)初速度 作產(chǎn)物甘油隨時間增加的曲線， 量出反應(yīng)初速度值 ， 換算為脂肪的消耗速度。如 8

26、g/h④換算活力 8g/h / 1g/h=8u⑤計算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白,,分離純化方法同蛋白質(zhì)純化類似：1.選材：酶含量豐富的新鮮生物材料2.細(xì)胞破碎：因材料而異,3.抽提：低溫下以水或低鹽緩沖液抽提4.分離及純化：粗分級，細(xì)分級分離,5. 結(jié)晶6.保存：低溫下酶粉可長期保存,注意低濃度酶溶液易變性,（三）酶的分離和純化,酶的分離純化,溶解度的差異,鹽

27、析法PEG沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點沉淀法,,熱穩(wěn)定性的差異,,熱處理沉淀法,電荷性質(zhì)的差異,離子交換層析法電泳法,,分子大小和形狀的差異,凝膠過濾法超濾法透析法離心法,,親和力的差異,親和層析法,,疏水作用的差異,,疏水層析法,分配系數(shù)的差異,,雙水相系統(tǒng)萃取法,由于酶的特殊性，在提純過程中要注意 :,1．全部操作在低溫0～4℃。,2．在分離提純過程中，不能劇烈攪拌。,3．在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑，如少量EDTA、

28、 少量β-巰基乙醇及蛋白酶抑制劑。,4．在分離提純過程中要不斷測定酶活力和蛋白質(zhì)濃度，從而求得比活力，還要計算總活力和回收率（得率）。,酶的純度：總活力 = 活力單位數(shù)/ mL酶液×總體積（ mL） 比活力 = 活力單位數(shù)/ 毫克蛋白,酶的純化鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、分子篩層析等。,衡量分離提純效果的兩個指標(biāo)①總活力的回收——得率（回收率） ——是表示提純過程中酶的損失情況②比活力

29、提高的倍數(shù) ——是表示提純方法的有效程度,酶的分離純化過程中一定要隨時追蹤酶的活性,,六、非蛋白質(zhì)生物催化劑——核酶（ribozyme),1982年美國科學(xué)家Altman和Cech研究Tetrahymena thermophiea（ 嗜熱四膜蟲） rRNA前體加工成熟時，發(fā)現(xiàn)具有催化活性（自我剪切功能）的天然RNA。,1983年美國S.Altman等研究 E.coli RNaseP（由23%蛋白質(zhì)和77%的RNA組成），

30、發(fā)現(xiàn)RNaseP中的RNA可催化E.coli tRNA的前體加工。,（一）核酶的發(fā)現(xiàn),1986年，T. Cech又發(fā)現(xiàn) L19 RNA 在一定的條件下能以高度專一性方式催化寡核苷酸底物的切割與連接。 基于Cech和Altman的創(chuàng)造性工作，將這類具有酶一樣的催化功能，本質(zhì)上不是蛋白質(zhì)而是RNA的生物大分子定義為Ribozymes。 該發(fā)現(xiàn)曾被認(rèn)為是生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一，為此Cech和Altman共同

31、榮獲1989年度諾貝爾化學(xué)獎。,隨后的研究表明： L19RNA具備酶促催化的幾個特征： 高度的底物專一性 遵循Michaelis-Menten動力學(xué) 對競爭性抑制劑的敏感性,,(2) 1992年，Piccirilli等發(fā)現(xiàn)L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA還有限制性內(nèi)切酶作用： -CpUpCpUpN- + G

32、 -CpUpCpU +GpN,,(4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽鏈，表明RNA具有肽基轉(zhuǎn)移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和兔肌1，4- ?-葡聚糖分枝酶,均包括RNA+蛋白組分，起催化作用的都是RNA。,（二）核酶的種類 自我剪切:是轉(zhuǎn)錄后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接: （self-

33、splicing）,I型內(nèi)含子：需要鳥苷和Mg2+參與,II型內(nèi)含子：不需要鳥苷的參與,,,剪切與連接,催化分子內(nèi)反應(yīng),催化分子間反應(yīng)：,,按作用底物,如RNase P、L19RNA,自我剪切核酶包括：發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶、錘頭結(jié)構(gòu)核酶、丁型肝炎病毒（HDV）核酶等。,（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶,由4個螺旋區(qū)和數(shù)個環(huán)狀區(qū)組成,切割活性所需最小長度為50個核苷酸,螺旋Ⅰ、Ⅱ決定核酶切割部位的特異性，螺旋Ⅲ配對堿基及其3′端的未配對堿基均為切割活性所必需,

34、,結(jié)構(gòu)特點,,結(jié)構(gòu)特點,三個螺旋,13個保守堿基,剪切點：GUN,（2）錘頭結(jié)構(gòu)核酶,,（3）HDV核酶和VS RNA,（三）核酶的研究意義與應(yīng)用前景,1、研究意義,突破了生物體內(nèi)所有的“生物催化劑都是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)觀念；對生命起源這一問題有了新的認(rèn)識 ；從生物進(jìn)化角度來看，生物催化劑從核酶到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變，伴隨著生物代謝高效率和生命現(xiàn)象的更趨復(fù)雜。,2、應(yīng)用前景,可以設(shè)計出自然界不存在的各種核酶。,核酶基因研究前景誘人，在基因治療領(lǐng)

35、域中倍受青睞，其研究進(jìn)展也相當(dāng)迅速。,酶工程就是利用酶的特異催化功能，對酶進(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術(shù)。包括：化學(xué)酶工程：(酶學(xué)+化學(xué)工程技術(shù)) 利用化學(xué)工程手段，改善酶的性能，提高催化效率, 降低成本。包括：天然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶、人工酶生物酶工程：(酶學(xué)+現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)) 以DNA重組技術(shù)為核心。包括：克隆酶、突變酶等。,七、酶工程,化學(xué)酶工程

36、 ——酶分子表面的修飾，酶分子內(nèi)部的修飾，化學(xué)合成人工酶 。1、微生物發(fā)酵得到粗酶2、對天然酶進(jìn)行化學(xué)修飾、固定化處理， 利用化學(xué)合成等手段來改善酶性能。,——天然酶,利用化學(xué)的手段對酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，改善酶的性能，以適用于工業(yè)的應(yīng)用及研究工作的要求。1、酶化學(xué)修飾的基本方法 （1）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 修飾酶的功能基團(tuán)： -NH3、 -SH、 -COOH 、咪唑基、酚羥基、吲哚基、胍基、甲硫

37、基等。修飾反應(yīng)：?；磻?yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化和還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等類型。,（一）化學(xué)修飾酶,其中水溶性的碳二亞胺類 特定修飾已成為最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法?？梢栽谳^溫和的條件下進(jìn)行，但一定條件下，Ser、Cys和Tyr也可反應(yīng)。,羧基的修飾,R,R’為烷基，HX 為鹵素、一級或二級胺；ENZ為酶,Lys的ε-NH2可采用烷基化反應(yīng)來修飾。修飾劑包括有乙酸酐、鹵代乙酸、芳基鹵和芳香族磺酸。其中，三硝基苯磺酸（TNBS）是種非常有效的氨基修

38、飾劑。反應(yīng)后在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。,氨基的修飾,此外，磷酸吡哆醛（PLP）、氰酸鹽、及蛋白質(zhì)測序中用的DNS（丹磺酰氯）、苯異硫氰酸酯（PITC）都可作為修飾劑。,具有兩個鄰位羥基的化合物。如丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯異二醛，都是重要的修飾劑。,胍基的修飾：,烷基化試劑是一種酶修飾劑，如碘乙酸。修飾產(chǎn)物相當(dāng)穩(wěn)定，易于分析。此外，馬來酸酐、馬來酰亞胺等修飾劑與巰基形成對酸穩(wěn)定的衍生物。 2-硝基苯甲酸（

39、DTNB），與-SH反應(yīng)形成S-S，釋放出一個2-硝基-5-硫苯甲酸陰離子。在412nm處有最大吸收。因而能通過光吸收的變化跟蹤反應(yīng)程度。,巰基的修飾,有機(jī)汞試劑（如對氯汞苯甲酸）對巰基專一性強(qiáng)，反應(yīng)物在250nm處有吸收,常用的修飾劑有，焦碳酸二乙酯（DPC）、碘代乙酸，能修飾咪唑基的兩個N原子。,ENZ,+,,+ CH3CH2OH + CO2,His咪唑基的修飾,O,,N,NH,,,,ENZ,C,,,O,C,O,,,,,

40、,,O,CH2CH3,,O,,CH2CH3,+,,pH4-7,ICH2COO-,pH>5.5,Trp殘基一般位于E分子內(nèi)部，而且比-SH、-NH2等一些親核基團(tuán)的反應(yīng)性差。所以一般不與常用的一些試劑反應(yīng)。 N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）可以修飾，并通過280nm處光吸收的減少跟蹤反應(yīng)。,色氨酸吲哚基的修飾,Tyr的修飾包括-OH和芳環(huán)上的取代修飾，Thr和Ser殘基的-OH都可被酚羥基的修飾劑修飾，但反應(yīng)條件嚴(yán)格些，生成的

41、產(chǎn)物也更穩(wěn)定。 四硝基甲烷（TNM）在溫和條件下可高度專一性地硝化酚羥基生成可電離的發(fā)色基團(tuán)3-硝基酪氨酸，在酸水解條件下穩(wěn)定，可用于氨基酸定量分析。,酪氨酸殘基和脂肪族羥基的修飾,甲硫氨酸甲硫基的修飾,過甲酸,甲硫基的化學(xué)修飾,碘乙酰胺,甲硫氨酸殘基極性較弱，在溫和條件下很難選擇性修飾。但是由于硫醚的硫原子具有親和性，可以用過氧化氫、過甲酸等氧化成甲硫氨酸亞砜。,（2）酶的化學(xué)交聯(lián),交聯(lián)劑是具有兩個反應(yīng)活性部位的雙功能基團(tuán)

42、可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。同型雙功能交聯(lián)劑:兩端具有相同的活性反應(yīng)基團(tuán)。可與氨基反應(yīng)的雙亞氨酸酯是一個典型的同型雙功能交聯(lián)劑。此外，N－羥琥珀酰亞氨酯、二硝基氟苯等。異型雙功能交聯(lián)劑：一端與氨基作用，另一端一般與巰基作用。但是用碳二亞胺時，第二個反應(yīng)基團(tuán)是羧基?？杀还饣罨母呓宦?lián)劑：一端與酶反應(yīng)后，經(jīng)光照，另一端產(chǎn)生一個活性反應(yīng)基團(tuán)（自由基）如碳烯或氮烯，它們具有高反應(yīng)性，沒有專一性。,使

43、用雙功能試劑如戊二醛、PEG等可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈之間進(jìn)行共價交聯(lián)，使酶分子活性結(jié)構(gòu)得以加固，提高其穩(wěn)定性。交聯(lián)酶晶體技術(shù)可以大幅度提高酶的生物活性和熱穩(wěn)定性。并且發(fā)現(xiàn)交聯(lián)晶體在有機(jī)溶劑中的催化活性和穩(wěn)定性提高。,例如，糖基化作用于交聯(lián)技術(shù)聯(lián)合使用應(yīng)用于青霉素G?；?，利用葡聚糖二乙醛將青霉素G?；附宦?lián)，55 ℃下半衰期提高9倍，Vmax 不變。此外，絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通過交聯(lián)修飾由常溫酶變?yōu)槭葻?/p>

44、酶，溫度從45 ℃提高到76℃,對修飾劑的要求：修飾劑具有較大的相對分子質(zhì)量，良好的生物相容性；分子表面有較多地反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長。,（3）大分子結(jié)合修飾,常用的化學(xué)修飾劑,A、糖及糖的衍生物　主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等； B、高分子聚物　聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇 （PVA）、聚N －乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）等； C、生物大分子　常用的有肝素、血漿

45、蛋白、聚氨基酸類等；蛋白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)等,大分子多聚物與具有生物活性的大分子物質(zhì)通過共價鍵將大分子連接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)產(chǎn)生改變。大分子在使用前要進(jìn)行活化，方法有：溴化氫法、高碘酸氧化法、疊氮法、三氯均三嗪法等,O,白蛋白與酶之間以羰二亞胺作為交聯(lián)劑的修飾反應(yīng),（修飾酶）,分子量在500-20 000 聚乙二醇類修飾劑應(yīng)用最廣，其生物相容性通過FDA認(rèn)證。其分子末端有兩個能被活化的羥基。分子修飾

46、時多采用單甲氧基聚乙二醇（MPEG）,MPEG—均三嗪衍生物MPEG—琥珀酰亞胺類衍生物MPEG—氨基酸類衍生物,肝素——含硫酸酯的粘多糖及適用于用來修飾溶解血栓酶類，增加酶的療效。,酶經(jīng)修飾后會產(chǎn)生各種各樣的變化，概括起來有： (1) 熱穩(wěn)定性提高 ①修飾劑共價連接于酶分子使其天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的“剛性”，并形成分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動，增加穩(wěn)定性； ②修飾劑本身增加了酶分子表面的親水性。 (2) 抗各類失活

47、因子的能力提高 ①修飾劑所產(chǎn)生的空間屏蔽有效的阻擋了各類失活因子； ②酶分子中對蛋白質(zhì)水解酶失活因子敏感基團(tuán)被修飾。 (3) 抗原性消除； (4) 體內(nèi)半衰期延長； (5) 最適pH改變； (6) 酶學(xué)性質(zhì)變化； (7) 對組織分布能力改變,2、修飾酶的特性,3、化學(xué)修飾的局限性,(1)某種修飾劑對某一氨基酸的化學(xué)修飾專一性是相對的。(2)化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象變化將妨礙對修

48、飾結(jié)果的解釋。(3)只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，對于維持酶的空間構(gòu)象的其它氨基酸側(cè)鏈，目前還不能用化學(xué)修飾方法研究這些氨基酸殘基酶的結(jié)構(gòu)與功能中的作用。(4)酶的化學(xué)修飾所提供的信息還得用X射線和其他方法來確定。,4、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用,解除醫(yī)用酶免疫原性和抗原性,1、固定化酶的特點: ①對溫度機(jī)械強(qiáng)度的穩(wěn)定性高；②可以反復(fù)使用 ③更適合多酶體系2、酶的固定化方法:（1）載體結(jié)合法:將酶結(jié)合于水不溶性載體的一

49、種固定化方法。根據(jù)結(jié)合的方式不同，又可分為物理吸附、離子結(jié)合和共價結(jié)合三種。 *物理吸附：借助非共價鍵把酶吸附到載體上，如活性碳。 *離子結(jié)合：通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體的固定化方法。載體為陰陽離子交換劑、樹脂等。 特點：易制備利用效率高，但酶易流失。 *共價結(jié)合法：通過共價鍵把與酶活性無關(guān)的氨基酸功能基團(tuán)連接在不溶于水的載體上。 特點：結(jié)合牢固，但得率低。,(二)固定化酶 (immobil

50、ized enzyme),（2） 包埋法 網(wǎng)格型：將酶包埋于高分子化合物形成的網(wǎng)格中 微囊型：將酶包埋在半透膜中 缺點：孔徑大小影響底物或 產(chǎn)物進(jìn)出（3）交聯(lián)法 通過雙功能試劑或多功能試劑（如戊二醛等）將酶蛋白與酶蛋白中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)，凝集成固定化酶. 常用的是戊二醛彼此交聯(lián),固定化酶法生產(chǎn)高果糖漿,也

51、稱果葡糖漿或異構(gòu)糖漿，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿。,淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖漿 → 膜過濾 → 濃縮 → 異構(gòu)化 → 部分變成果糖（42%）→混合 →濃縮、精制→ 55%高果糖漿參與的酶：α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖異構(gòu)酶,高果糖漿的生產(chǎn)流程,固定化葡萄糖異構(gòu)酶 葡萄糖

52、 果糖 42%高果糖玉米糖漿：215萬噸/年 55%高果糖玉米糖漿：145萬噸/年,,（三）人工酶（synzyme),人工酶又稱模擬酶或酶模型，吸收酶中起主導(dǎo)作用的因素，利用有機(jī)化學(xué)或生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成的一些較天然酶簡單的具有催化能力的蛋白或非蛋白分子。人工酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)理和立體化學(xué)等特性的技術(shù)。必須具

53、備兩個結(jié)構(gòu)要素：一是底物結(jié)合位點；另一是催化位點。,難度大，產(chǎn)品活性低，發(fā)展緩慢。,（四）催化性抗體 (abzyme)： 也稱抗體酶，是一種具有催化功能的抗體分子。其抗原結(jié)合部位被賦予了催化功能 設(shè)計思想： ① 抗原與抗體的結(jié)合是在基態(tài)進(jìn)行的 ② 抗原- 抗體結(jié)合表面積更大 ③ 抗體可做成具有高度專一性分子主要制備方法： (半)抗原(過渡態(tài)類似物) →免疫誘導(dǎo)→抗體→篩選具有催化功

54、能的單克隆抗體→抗體酶 穩(wěn)定過渡態(tài)法、抗體與半抗原互補法、抗體結(jié)合部位修飾法、多底物類似法、抗體庫法等,1986年得第一個抗體酶： 以羧酸二脂反應(yīng)的過渡態(tài)類似物——對硝基苯磷酰膽堿為半抗原，從誘導(dǎo)產(chǎn)生的單抗中得到了能使催化反應(yīng)速度加快12,000倍的抗體酶。 這些抗體酶具有服從米氏動力學(xué)、有底物專一性、具有PH和溫度的依賴性等酶的特性近況： 目前已經(jīng)得到可催化所有六大類酶促反應(yīng)的抗體酶，

55、催化活性與天然酶接近或相當(dāng),生物酶工程,生物酶工程是酶工程發(fā)展的新階段，是酶學(xué)和以DNA重組技術(shù)為核心的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。生物酶工程研究的三方面的內(nèi)容： ①克隆酶：獲取天然酶基因，將其克隆到微生物體內(nèi)，大規(guī)模生產(chǎn)酶產(chǎn)品。 ② 突變酶：對天然酶基因進(jìn)行定點突變、遺傳修飾，再進(jìn)行克隆生產(chǎn)。 ③ 設(shè)計新的酶基因——產(chǎn)生自然界沒有的新酶,1、酶克隆技術(shù)的基本方法：,獲取天然酶基因

56、 ? 加上啟動子及其它調(diào)節(jié)序列 ? 克隆到載體（質(zhì)粒） ? 轉(zhuǎn)化到受體菌 ? 通過發(fā)酵方法大規(guī)模生產(chǎn) ? 分離純化目的產(chǎn)品（酶）,酶克隆技術(shù)使酶的生產(chǎn)能力提高第一個基因工程菌生產(chǎn)的酶制劑 —

57、— ? - 淀粉酶2、酶基因的修飾 ——突變酶 蛋白質(zhì)工程的興起使人們實現(xiàn)對酶蛋白的改造突變酶的獲得： 利用定點誘變技術(shù)，改造酶基因的特定部位的DNA順序，產(chǎn)生被改造的、具有優(yōu)化了的理化性質(zhì)或催化功能的酶蛋白。例如：枯草桿菌蛋白酶 Met 222 ? Lys， 更耐受堿性環(huán)境（最適PH8.6 ?9.6）,3、設(shè)計新的酶基因,對酶分子的改造著眼于兩個方面： 一是基于序列的合理化設(shè)計方案，如修飾、

58、定點突變等 二是利用基因的可操作性，模擬自然界的演化進(jìn)程的非 合理設(shè)計方案，如定向進(jìn)化、雜合進(jìn)化等（1）酶分子的體外定向進(jìn)化：酶分子的定向進(jìn)化（directed evolution): 人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的酶——進(jìn)化酶,酶分子體外進(jìn)化原理：,,,,天然酶基因,,易錯PCR,,篩選平板,對照平板,

59、,隨機(jī)突變庫,有益突變的酶基因可做為模版進(jìn)行新一輪進(jìn)化,,,高酶活基因,高[Mg2+],,隨機(jī)片斷庫,DNase I,有性PCR,,隨機(jī)片斷化,,,,,,,隨機(jī)重組庫,,裝入載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化、篩選,,精確測定酶活力及熱穩(wěn)定性等,,進(jìn)化基因序列測定,結(jié)果分析,,（2）雜交酶 (hybrid enzyme)定義：借助基因操作技術(shù)，把來自不同酶分子的結(jié)構(gòu)單元，包括結(jié)構(gòu)域、亞結(jié)構(gòu)域或整個酶分子進(jìn)行組合或互換，從而得到所需性質(zhì)的新酶方法：蛋白