細(xì)菌內(nèi)膜蛋白插入酶YidC的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、細(xì)胞中有超過三分之一的蛋白是膜蛋白，這些膜蛋白的生理功能角色非常廣泛，包括ATP酶，各種離子通道以及通透酶等等。對于細(xì)胞來說，要將這么多的膜蛋白順利地轉(zhuǎn)運(yùn)插入到磷脂雙分子層將是一個非常關(guān)鍵和具有挑戰(zhàn)性的生理活動。分布于細(xì)菌、葉綠體、線粒體中的YidC/Alb3/Oxal家族蛋白很早就被鑒定出具有催化膜蛋白插入磷脂雙分子層的功能。細(xì)菌中的YidC除了可以獨立地將一部分膜蛋白作為底物催化插入到磷脂雙分子層，還可以輔助SecYEG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。S

2、ecYEG是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道，除了負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)大部分分泌蛋白，它還負(fù)責(zé)催化大部分膜蛋插入到細(xì)胞膜，后一過程中，往往需要YidC的協(xié)同參與。目前關(guān)于YidC的具體功能機(jī)制，大部分還不清楚。許多以往的研究表明，新生膜蛋白特定區(qū)域的帶電氨基酸的分布對于其對YidC的依賴性起著非常關(guān)鍵的作用。
　　本論文中，我們解析了來自于Thermotoga maritima種屬中的YidC(TmYidC)3.8(A)分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。TmYi

3、dC的C端五次跨膜螺旋相互作用在一起，形成一個親水性的溝渠結(jié)構(gòu)，這五個跨膜螺旋的周質(zhì)側(cè)半葉相互緊密地聚束在一起，形成溝渠的封口端，而胞質(zhì)側(cè)半葉則松散地相互作用在一起，形成溝渠的開口端。溝渠內(nèi)存在的五個保守的極性氨基酸(Gln322、Arg260、Ser371、Thr374和Asn413)使得跨膜區(qū)具有明顯的親水性。另外，我們單獨解析了TmYidC周質(zhì)側(cè)第一個可溶區(qū)結(jié)構(gòu)域(TmYidCP1)2.5(A)分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。
　　Pf3

4、是一個非SecYEG通道依賴性的YidC底物膜蛋白，它可以被YidC獨立地轉(zhuǎn)運(yùn)插入到磷脂雙分子層。我們利用體內(nèi)光交聯(lián)的實驗手段，對YidC和Pf3之間相互作用的位點進(jìn)行了研究。YidC的五次跨膜螺旋可以形成兩個α五螺旋束，我們發(fā)現(xiàn)Pf3可以從這兩個α-螺旋束所形成的TM3-TM5界面離開YidC的溝渠結(jié)構(gòu)，繼而進(jìn)入磷脂雙分子層。通過在YidC內(nèi)部人為引入二硫鍵的方法，我們發(fā)現(xiàn)YidC中兩個α-螺旋束周質(zhì)側(cè)的運(yùn)動性對YidC的活性非常重要

5、。負(fù)責(zé)連接第三個跨膜螺旋和第四個跨膜螺旋的P2loop包裹住了整個溝渠結(jié)構(gòu)的周質(zhì)側(cè)一端，該loop上含有兩個十分保守的負(fù)電性氨基酸，這些保守的負(fù)電氨基酸導(dǎo)致溝渠的周質(zhì)側(cè)一端呈現(xiàn)出一定程度的負(fù)電勢。我們發(fā)現(xiàn)該負(fù)電氨基酸對于YidC的功能實現(xiàn)是必需的，因此推測P2loop上保守的負(fù)電性氨基酸在YidC催化底物進(jìn)入磷脂分子層時發(fā)揮著重要作用。總之，我們的實驗表明現(xiàn)YidC跨膜區(qū)的周質(zhì)側(cè)部分(包括P2loop)雖然遠(yuǎn)離YidC核心的親水性溝渠結(jié)