酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)與功能特性的研究.pdf

1、兩親嵌段共聚物以合成的聚合物體系和天然的大分子體系為主，前者如聚酸酐，聚丙烯酸及其衍生物等，后者如酪蛋白，明膠，殼聚糖等。由于天然高分子材料具有性能穩(wěn)定、無(wú)毒、應(yīng)用安全、生物相容性好及成膜或成球性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注。因此，在發(fā)展新材料的同時(shí)，對(duì)一些天然的兩親嵌段型蛋白分子進(jìn)行改造、更新和發(fā)展，可拓展其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。從物理化學(xué)基礎(chǔ)研究來(lái)看，分子結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)對(duì)兩親嵌段共聚物聚集體的結(jié)構(gòu)形成與演變有著極其重要的

2、影響，而聚集體結(jié)構(gòu)的變化為其在相關(guān)領(lǐng)域的功能性應(yīng)用提供了更加多樣化的選擇。本論文的工作是基于上述研究背景以及發(fā)展趨勢(shì)展開(kāi)的，圍繞不同物理化學(xué)條件下兩親嵌段型酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)、形態(tài)以及環(huán)境因素對(duì)體系聚集態(tài)行為的影響進(jìn)行深入研究，同時(shí)研究酪蛋白膠束與納米金之間的相互作用，并在酪蛋白溶液中，制備了尺寸和形貌可控的納米金膠，主要得到了以下幾方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.首次以熒光光譜(以酪蛋白分子的內(nèi)源熒光探針和外加熒光探針芘和1-苯胺基萘-8

3、-磺酸為研究對(duì)象)測(cè)試技術(shù)，同時(shí)結(jié)合DLS，CD和濁度等方法研究了酪蛋白膠束形成，及pH值對(duì)膠束結(jié)構(gòu)-特性的影響。酪蛋白在pH 2.0至3.0，和pH5.5至12.0條件下，皆可以形成膠束，疏水作用、氫鍵作用和鹽鍵作用在酪蛋白膠束的形成過(guò)程中起到了重要作用。同步熒光研究結(jié)果表明，在酪蛋白自組裝形成膠束過(guò)程中，Trp殘基和Tyr殘基之間的距離逐漸接近，兩者之間相互作用加強(qiáng)，可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。陰離子熒光探針ANS的研究表明酪蛋白單體分子的疏水

4、區(qū)域無(wú)法結(jié)合ANS；酪蛋白分子的疏水區(qū)域自組裝形成膠束時(shí)，可提供ANS結(jié)合所需的疏水區(qū)域，使其發(fā)射波長(zhǎng)明顯降低。隨著體系pH值降低，ANS與酪蛋白膠束的結(jié)合作用明顯加強(qiáng)，而當(dāng)體系pH值較高時(shí)，僅有少部分ANS分子與酪蛋白膠束結(jié)合，表明ANS與酪蛋白膠束的結(jié)合過(guò)程中，疏水作用和靜電作用同時(shí)發(fā)揮作用，并且后者更為重要。中性芘分子的研究表明，膠束結(jié)構(gòu)的疏松程度對(duì)芘與酪蛋白膠束之間的結(jié)合影響非常顯著。膠束結(jié)構(gòu)較為致密時(shí)，芘分子的剛性結(jié)構(gòu)阻礙芘分

5、子與較深的疏水區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致較高的I1/I3和較低的Ie/I1；當(dāng)膠束結(jié)構(gòu)較為疏松時(shí)，則反之。CD結(jié)果還表明，在形成膠束以后，酪蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，其β-折疊含量降低，α-螺旋含量增加。綜合以上結(jié)果可知，酪蛋白膠束表面和內(nèi)核皆存在疏水區(qū)域可結(jié)合有機(jī)小分子，pH值對(duì)探針?lè)肿优c酪蛋白膠束之間的結(jié)合作用存在明顯影響，這為酪蛋白膠束在生物醫(yī)學(xué)上作為藥物載體提供了有益的理論依據(jù)。 2.以等溫滴定微量熱、濁度、熒光光譜、DL

6、S和TEM等測(cè)試手段研究了陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)與酪蛋白膠束的相互作用。研究結(jié)果表明，在DTAB濃度低于c1(1.38mM)時(shí)，DTAB單體分子以靜電作用與酪蛋白膠束的負(fù)電荷位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致△Hobs增加。同時(shí)，酪蛋白膠束表面所荷凈負(fù)電荷降低，膠束的結(jié)構(gòu)更為致密，因此，Trp殘基與芘分子所處微環(huán)境的極性降低。與此相反，由于陰離子探針ANS與DTAB極性頭間的靜電作用，其位于膠束表面的較親水的環(huán)境。當(dāng)DTAB濃度高

7、于c1(1.38mM)時(shí)，DTAB在酪蛋白膠束上生成膠束狀聚集體，導(dǎo)致了不溶酪蛋白/DTAB復(fù)合物的生成。當(dāng)DTAB濃度增至c'時(shí)，由于與酪蛋白膠束結(jié)合的DTAB分子不斷增加，而使酪蛋白/DTAB復(fù)合物帶上凈的正電荷，復(fù)合物極性增加，溶解度增加。此外，由于與酪蛋白結(jié)合的膠束狀DTAB聚集體的存在及聚集體之間的靜電作用，導(dǎo)致體系中酪蛋白/DTAB復(fù)合體的結(jié)構(gòu)比較疏松，粒徑相對(duì)于酪蛋白膠束有所增加。因此，Trp殘基和芘分子所處微環(huán)境極性增加

8、。當(dāng)DTAB濃度大于c2時(shí)，與酪蛋白膠束結(jié)合的DTAB分子達(dá)到飽和，體系中生成DTAB自由膠束。研究結(jié)果還表明，在大量鹽存在的情況下，酪蛋白與表面活性劑之間的靜電作用受到很大屏蔽；鹽的加入同時(shí)屏蔽了表面活性劑極性頭基之間的靜電斥力作用，從而有利于自由膠束的形成，抑制了DTAB分子與酪蛋白膠束的結(jié)合。 3.以熒光光譜法、圓二色譜、等溫滴定微量熱和DLS等測(cè)試手段研究了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉SDS對(duì)酪蛋白膠束特性的影響。由于

9、SDS與酪蛋白膠束之間強(qiáng)烈的疏水作用，SDS的加入導(dǎo)致酪蛋白膠束的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生明顯變化。SDS濃度低于臨界聚集濃度(c1)時(shí)，SDS單體分子以疏水作用與酪蛋白膠束的疏水區(qū)域結(jié)合，當(dāng)其濃度增加至c1時(shí)，SDS聚集體于酪蛋白鏈上形成，c1數(shù)值遠(yuǎn)低于SDS于水中的臨界膠束濃度(cmc)。SDS濃度進(jìn)一步增加至臨界膠束濃度c2時(shí)，SDS自由膠束生成，與酪蛋白/SDS復(fù)合體共存于體系中。DLS結(jié)果確證了酪蛋白-SDS復(fù)合體的形成，結(jié)合于酪蛋白

10、膠束疏水區(qū)域的SDS聚集體導(dǎo)致酪蛋白膠束膨脹，從而使復(fù)合體尺寸有所增加。酪蛋白內(nèi)源熒光的研究表明，SDS與酪蛋白的疏水區(qū)域結(jié)合后，阻礙了色氨酸與酪氨酸殘基之間的能量傳遞。外加探針芘和ANS的熒光研究表明，SDS的加入幾乎未影響酪蛋白疏水區(qū)域的微極性，卻抑制了芘的激基復(fù)合物生成。同時(shí)，SDS與ANS之間的靜電斥力作用明顯抑制了ANS與酪蛋白膠束的親合性。CD測(cè)試顯示，SDS的加入使酪蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯變化。 4.在酪

11、蛋白溶液中，以簡(jiǎn)單易行的方法制各了形態(tài)和尺寸可控的納米金；同時(shí)以紫外光譜、XRD、透射電鏡和電子衍射等測(cè)試手段對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行表征。熒光光譜和NMR測(cè)試結(jié)果表明，HAuC14可直接與酪蛋白膠束表面及內(nèi)部的氨基、羧基或二硫鍵等基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，并且可以均勻地分散到每個(gè)膠束核內(nèi)。酪蛋白膠束與HAuC14混合溶液在室溫下，在不引入其它還原劑條件下，可生成形貌和尺寸可控的納米金。酪蛋白濃度較低時(shí)，體系中主要生成三角片狀和十面體納米金，大尺寸三角片狀納米金

12、比例較高；當(dāng)酪蛋白濃度較高時(shí)，由于酪蛋白膠束較強(qiáng)的保護(hù)作用，體系中主要生成球狀納米金，僅有少量三角片狀和十面體納米金生成。在制備納米金過(guò)程中，酪蛋白除起到模板和保護(hù)作用，還起到還原劑作用。當(dāng)酪蛋白濃度較低時(shí)，酪蛋白分子可優(yōu)先吸附于納米金的(111)表面，而使納米金沿著其它晶面接觸互相結(jié)合生長(zhǎng)，形成較大的多角納米金。當(dāng)酩蛋白濃度較高時(shí)，酪蛋白膠束較強(qiáng)烈的保護(hù)作用，使小尺寸的納米金不再隨時(shí)間繼續(xù)“生長(zhǎng)”，主要以小尺寸的球狀納米金存在。當(dāng)體系

13、中有納米金晶種存在時(shí)，酪蛋白分子可進(jìn)一步還原體系中未反應(yīng)的Au(Ⅲ)。所制備納米金多為球狀，有少部分三角狀和十面體納米金存在。pH值對(duì)制備納米金的影響結(jié)果進(jìn)一步表明，質(zhì)子化的氨基在氯金酸的還原中起到了重要作用。 5.以紫外可見(jiàn)吸收光譜、TEM、熒光光譜法、zeta-電勢(shì)法研究了納米金膠(GNP)與酪蛋白膠束(CM)之間的相互作用。紫外-可見(jiàn)吸收光譜研究結(jié)果襄明，由于GNPs與酪蛋白膠束的結(jié)合，GNPs所處環(huán)境的介電常數(shù)發(fā)生了變

14、化，從而導(dǎo)致其特征共振吸收峰紅移。TEM測(cè)試結(jié)果表明，酪蛋白膠束存在時(shí)，金納米粒子之間的距離明顯縮小，形成了球狀納米金團(tuán)簇。金納米粒子基本限定在球狀結(jié)構(gòu)之內(nèi)，但在球狀納米金團(tuán)簇中可觀察到界面清晰的金納米粒子，沒(méi)有出現(xiàn)金納米粒子的團(tuán)聚和聚沉。金納米粒子粒徑的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：酪蛋白膠束與納米金的結(jié)合并未影響金納米粒子的粒徑。熒光光譜法測(cè)試結(jié)果表明，納米金與酪蛋白膠束的結(jié)合并未使酪蛋白分子中色氨酸殘基發(fā)生峰位移，也未使芘探針?biāo)幍奈h(huán)境極性