人博卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白功能的初步研究.pdf

1、2005年科學(xué)家Allander利用PCR技術(shù)，通過借助信息學(xué)相關(guān)方法對嬰幼兒鼻咽分泌物樣本進(jìn)行大范圍排查，發(fā)現(xiàn)了一類新型細(xì)小病毒，即人博卡病毒(HumanBocavirus，HBoV)。HBoV是一種直徑約為18-25nm，無囊膜，單鏈線性DNA病毒，基因組大小約為5300 nt，其外包被著T=1的二十面體的蛋白衣殼，以保護(hù)DNA不受外界環(huán)境如高溫、PH變化、高鹽等影響。感染HBoV的患者外表癥狀多為發(fā)燒、咳嗽、喘息等下呼吸道感染癥狀

2、，少數(shù)病情嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸窘迫的現(xiàn)象。HBoV屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒亞科，博卡病毒屬。
　　 HBoV基因組含有兩個(gè)主要開放閱讀框，一個(gè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NP1，另一個(gè)則轉(zhuǎn)錄翻譯兩個(gè)衣殼蛋白VP1和VP2；VP1的5’端獨(dú)特區(qū)VP1-Unique序列具有磷脂酶A2活性，這種活性與病毒的感染性有關(guān)，已有的一些資料表明，基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域比較保守，而變化的部分位于編碼核衣殼蛋白的區(qū)域；在基因組DNA的3’端和5’端分別

3、存在一個(gè)末端反向重復(fù)序列(Invertedterminal repeat，ITR)，其會(huì)形成反轉(zhuǎn)回文結(jié)構(gòu)，細(xì)小病毒DNA復(fù)制時(shí)是以該末端兩部分反轉(zhuǎn)互補(bǔ)的回折部分作為的引物。
　　 本研究依據(jù)人博卡病毒基因序列(GeneBank：GU139423)設(shè)計(jì)VP1抗原表位區(qū)域(4160-4480 nt)的引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，并將擴(kuò)增的片段插入到質(zhì)粒pET-49b(+)中，通過IPTG誘導(dǎo)融合蛋白，并用切膠純化的方法切取融合

4、蛋白，研磨并用PBS溶解，之后將制備的融合蛋白樣免疫小鼠，最終得到VP1多克隆抗體，為今后研究人博卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 同時(shí)，為了弄清楚人博卡病毒VP1、VP2以及NS1蛋白在細(xì)胞中的分布情況，本實(shí)驗(yàn)還將這幾個(gè)蛋白的基因分別克隆到真核表達(dá)載體pEGFP系列上，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T細(xì)胞中，觀察VP1、VP2以及NS1蛋白在細(xì)胞中的定位分布。然而，在研究蛋白定位的同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)