粘細菌外膜蛋白發(fā)育相關基因的篩選及功能研究.pdf

1、目的：粘細菌屬于最簡單的具有多細胞發(fā)育結構的生物體之一，其發(fā)育過程與真核生物存在相似性。粘細菌屬原核生物，生活周期具社會性行為，是研究多細胞結構形態(tài)發(fā)生機制的良好模型。作為細胞與外界環(huán)境問的界面，細胞膜幾乎與發(fā)育中各種生物活動密切相關，然而迄今為止所克隆的與粘細菌發(fā)育相關的膜蛋白基因數(shù)量非常有限，一些重要的應定位于細胞膜的蛋白因子一直未能找到。本論文擬找出在粘細菌發(fā)育階段表達量上調的膜蛋白基因，并對這些新蛋白因子進行基因敲除實驗，以明確

2、其生物學功能。 方法：本實驗最初使用雙向電泳技術對粘細菌發(fā)育與非發(fā)育階段細胞膜蛋白的表達進行了研究。隨后利用六種外膜蛋白預測軟件對粘細菌基因組讀碼框編碼產(chǎn)物進行結構預測，將六種軟件均預測為外膜蛋白的基因篩選出來，分別構建轉錄融合載體，即將其上游的調控區(qū)域與報告基因lacZ相連，經(jīng)電穿孔分別導入粘細菌野生株DK1622，通過測定重組菌株β-半乳糖苷酶活性尋找出粘細菌發(fā)育階段表達的基因。對篩選到的基因進行基因敲除，觀察該敲除菌株的

3、表型變化以初步明確其生物學功能。 結果：1.在雙向電泳實驗中，比較幾次實驗所得到粘細菌在營養(yǎng)性生長和發(fā)育12h的2-D圖譜，發(fā)現(xiàn)每次實驗均存在一些發(fā)育階段蛋白量明顯增加的點，但是不同次實驗的重復性較差，我們從中挑選了5個在兩次以上實驗中蛋白量均有明顯增加的斑點進行了質譜分析，但質譜分析結果均沒有得到粘細菌膜蛋白。2.利用生物信息學軟件分析，在粘細菌基因組中篩選出了12個編碼外膜蛋白的基因。報告基因檢測結果提示其中2個基因(Mx

4、3106，Mx3883)在發(fā)育起始階段表達量上升，通過氨基酸序列比較，基因Mx3106所編碼的蛋白與粘細菌中對IV型菌毛的形成以及S運動至關重要的PilQ同源。Mx3883與革蘭氏陰性菌分子伴侶/引領蛋白通路中的引領蛋白同源，其所在操縱子與粘細菌孢子外殼蛋白的分泌有關。其余十個基因均與物質跨膜運輸有關，在發(fā)育階段表達量均下降或未表達。其中Mx1316，Mx4559，Mx6044，Mx6579，Mx6911為TonB依賴的外膜蛋白受體，主

5、要在大分子跨膜物質運輸中起重要作用。3.通過同源重組獲得Mx3106和Mx3883基因敲除菌株。這兩種敲除菌株在營養(yǎng)豐富的固體平板表面運動無異常，在饑餓平板能正常聚集發(fā)育為子實體，在現(xiàn)有實驗條件下對孢子的形成也無影響。 結論：1.利用生物信息軟件分析粘細菌基因組讀碼框，預測出12個可能編碼外膜蛋白的基因?；騇x3106和Mx3883在發(fā)育時期表達上調，其余10個基因在發(fā)育時期幾乎不表達或表達下降，這10個基因均與物質跨膜轉運