植物乳桿菌細(xì)菌素基因座遺傳分析與基因plnEF外源表達(dá)研究.pdf

1、植物乳桿菌可以適應(yīng)惡劣的葡萄酒環(huán)境，啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵，具有產(chǎn)生植物乳桿菌細(xì)菌素的能力，抑制或殺死葡萄酒中有害乳酸菌，防止葡萄酒的破敗，部分替代二氧化硫的作用，從而降低葡萄酒中二氧化硫的使用。因此篩選產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，十分必要。
　　本試驗(yàn)首先通過共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)菌素，從14株植物乳桿菌中成功篩選獲得兩株產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌XJ25和PC520。其次，利用兩株菌基因組重測序手段，進(jìn)一步比較分析其植物乳

2、桿菌素（Plantaricin，pln）基因座間存在的差異，獲得植物乳桿菌素pln基因座遺傳圖譜。最后構(gòu)建基因plnE和plnF的外源表達(dá)載體，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量重組蛋白，并對(duì)其進(jìn)行初步的純化。主要研究結(jié)果如下:
　　1)14株植物乳桿菌中，菌株XJ25和PC520抑菌范圍大，抑菌性較強(qiáng)，且對(duì)醋酸菌有一定的抑制作用;植物乳桿菌中共培養(yǎng)現(xiàn)象是普遍存在的，菌株X J25和PC520與糞腸球菌XJ26M共培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)菌素。通過對(duì)7株乳酸菌(

3、XJA2，201，205，216，509，594，542)進(jìn)行16SrRNA及recA基因的擴(kuò)增分析，鑒定7株菌為植物乳桿菌，并且RAPD分析12株植物乳桿菌隨機(jī)擴(kuò)增片段的多態(tài)性，表明了其基因組DNA的多態(tài)性。
　　2)菌株XJ25和PC520的pln基因座結(jié)構(gòu)相似，均由6個(gè)操縱子(plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUVW、plnABCD、plnMNOP、plnWXY)組成，其中plnABCD是三組分調(diào)節(jié)操縱子。并且菌株

4、X J25和PC520均存在一個(gè)新的未知功能的or f1。植物乳桿菌菌株P(guān)C520的部分基因(plnY，plnS)等發(fā)生缺失，菌株XJ25的plnF基因編碼蛋白在14位(A-S)和42位(V-I)有兩個(gè)氨基酸突變。
　　3)通過一步定向克隆技術(shù)，引物設(shè)計(jì)與線性質(zhì)粒兩端同源片段，成功將目的片段插入質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化的效率很高。優(yōu)化重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件，選擇在18℃，150rpm，IPTG濃度0.6mM，誘導(dǎo)時(shí)間12h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。