六個miniSTR基因座群體遺傳學研究.pdf

1、目的：短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats，STR）遺傳標記系統(tǒng)，由于在人類基因組中分布廣泛，具有高度的遺傳多態(tài)性以及簡單快捷的檢測方法，已成為法醫(yī)物證鑒定的主流技術(shù)。然而，在法醫(yī)學實踐中經(jīng)常會面臨高度降解的檢材，如使用商品化STR試劑盒進行擴增，片段較大的STR基因座往往無法得到正確的分型或是分型失敗。miniSTR基因座分析技術(shù)即是在設(shè)計引物時，使其盡可能靠近核心重復序列從而縮短擴增片段長度，以提高檢測的靈敏度及

2、降解片段的檢出率。miniSTR基因座已被歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組（the european DNA profiling group，EDNAP）定義為繼STR之后的新一代遺傳標記，2006年美國AB公司已經(jīng)研制開發(fā)了MiniFiler試劑盒。miniSTR，miniX-STR，miniY-STR的研究已顯示了其在法醫(yī)學領(lǐng)域的重要價值。miniSTR應用于法醫(yī)學時，進行準確、快速、方便的分型檢測顯得至關(guān)重要，因此對其分型結(jié)果的準確性、公正性

3、和可靠性提出了更高的要求。而等位基因分型標準物（allelic ladder，簡稱AL）的制備又是實現(xiàn)基因座準確分型命名的關(guān)鍵。只有具備了一套精確的、國際標準化命名的分型標準物，才有可能對miniSTR分型結(jié)果做出正確判型和命名，才有可能在各國、各實驗室之間實現(xiàn)miniSTR分型的可比性。為研究更多的miniSTR基因座用于法醫(yī)學鑒定，解決一些疑難檢材的DNA分型，本課題擬采用分子克隆技術(shù)制備六個miniSTR基因座D10S1248、D

4、2S441、D1S1677、D9S1122、D10S1435和D17S1301等位基因分型標準物，解決miniSTR分型的準確性和標準化問題，并應用于湖南漢族群體遺傳學研究中，探討該方法制備的等位基因分型標準物在法庭科學實踐中的應用價值。
　　 方法：采用Chelex-100法提取155份湖南漢族無關(guān)健康個體全血基因組DNA。采用PCR擴增，10％變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，銀染顯色，在所選樣本中篩選、分離六個miniSTR基因

5、座所有目的等位基因，用Promega公司凝膠回收試劑盒純化后，將其分別插入到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)染DH5αTM感受態(tài)大腸桿菌，擴大培養(yǎng)，4％瓊脂糖凝膠電泳初步篩選陽性克隆，測序證實連接正確目的等位基因的核心序列結(jié)構(gòu)和重復次數(shù)，并按照國際法庭血液遺傳學學會（international society of forensic haemogenetics，ISFH）推薦的命名原則對各等位基因命名；提取重組質(zhì)粒，以其為模板進行PCR擴增，根據(jù)

6、瓊脂糖檢測的顯色強度或GeneQuant微量蛋白核酸檢測儀對擴增產(chǎn)物的定量結(jié)果，調(diào)整各成分的比例，使峰高盡可能達到平衡，混合各等位基因PCR擴增產(chǎn)物，即獲得各miniSTR基因座的等位基因分型標準物。
　　 應用自制miniSTR基因座等位基因分型標準物進行所選樣本的群體遺傳學研究：將基因座D10S1248和D17S1301上游引物5’端用6-FAM熒光標記，基因座D2S441和D9S1122上游引物5’端用HEX熒光標記，基因