四株乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究.pdf

1、乳酸菌代謝產(chǎn)生很多物質(zhì)如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和雙乙酰等都可以通過(guò)改變食品的內(nèi)在特性來(lái)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，人們很久以前就開(kāi)始認(rèn)識(shí)和使用這些終產(chǎn)物，但是人們卻忽略了乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的作用。人們?cè)谑称分袩o(wú)意識(shí)的使用了幾千年的乳酸菌細(xì)菌素，但直到最近幾十年才開(kāi)始真正研究它們。細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的抑菌肽或蛋白，這些物質(zhì)可以殺滅和抑制與之相同或相似生境的其他微生物。雖然許多細(xì)菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素，但乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素更適合在食品工業(yè)中應(yīng)用。現(xiàn)在只有幾種商

2、品化的細(xì)菌素面市，如nisin和pediocin PA-1，nisin作為食品添加劑可以非常有效的抑制許多食品中的腐敗菌，并延長(zhǎng)其貨價(jià)期。但由于其不能抑制革蘭氏陰性菌和抑菌活性的不穩(wěn)定限制了它在食品工業(yè)中的發(fā)展，所以我們要繼續(xù)大力開(kāi)發(fā)其他乳酸菌細(xì)菌素。 本研究從67株乳桿菌中篩選出四株具有抑菌活性的乳桿菌菌株：短乳桿菌(KLDS1.0355)、馬乳酒樣乳桿菌(KLDS1.0373)、棒狀乳桿菌棒狀亞種(KLDS1.0391)和布

3、氏乳桿菌(KLDS1.0364)，這四株乳桿菌均分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中。在排除有機(jī)酸和過(guò)氧化氫的干擾后，四株菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液對(duì)指示菌還有強(qiáng)烈的抑制作用。經(jīng)蛋白酶K處理后，抑菌活性喪失，證明無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液中含有蛋白性質(zhì)的抑菌物質(zhì)，即細(xì)菌素。四株菌經(jīng)初步鑒定為短乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、棒狀乳桿菌棒狀亞種和布氏乳桿菌。 優(yōu)化四株乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的條件，確定了最大產(chǎn)量時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度，即KLDS1.0355、KLDS1.03

4、73、KLDS1.0364.30℃培養(yǎng)24h，KLDS1.0391 30℃培養(yǎng)28h。優(yōu)化了培養(yǎng)基的氮源和碳源成分，培養(yǎng)基氮源為1％胰蛋白胨、0.5％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.5％酵母提取物，碳源為4％葡萄糖時(shí)，四株菌產(chǎn)生的細(xì)菌素抑菌活力最強(qiáng)，分別達(dá)到270.64IU/ml、333.91 IU/ml、574.72IU/ml和295.49IU/ml。 對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行了純化，首先采用硫酸銨沉淀蛋白，然后用SP Sepharose F

5、ast Flow陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析，條件為：流速1ml/min，用含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液可洗脫下細(xì)菌素峰，凍干濃縮后，四株乳桿菌細(xì)菌素的比活力可達(dá)到74.20 IU/mg、44.75 IU/mg、102.77 IL//nag和54.53IU/mgo純化后的細(xì)菌素樣品經(jīng)凍干濃縮后，用Tricine-SDS-PAGE測(cè)定了它們的分子量，其中KLDS1.0355產(chǎn)生的細(xì)菌素分子量約為15.9kD，KLD

6、S1.0373產(chǎn)生的細(xì)菌素分子量約為20.1kD，KLDS1.0364產(chǎn)生的細(xì)菌素分子量約為21.6 kD。 研究了四株菌產(chǎn)細(xì)菌素的生物學(xué)特性。KLDS1.0373、KLDS1.0391和KLDS1.0364產(chǎn)生的細(xì)菌素可以被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K完全失活，KLDS1.0355產(chǎn)生的細(xì)菌素可被除α-糜蛋白酶以外的其他四種蛋白酶完全失活，可被α-糜蛋白酶部分失活。四株乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素都不能被α-淀粉酶失活，說(shuō)明

7、這四株乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素沒(méi)有碳水化合物部分起抑菌作用。四株乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH2～10的范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。在80℃熱處理30min后活性無(wú)明顯變化，在121℃30min的高溫下活性不降低，并有所上升。說(shuō)明這四種細(xì)菌素是具有良好的熱、酸穩(wěn)定性的蛋白活性物質(zhì)，具有較高的安全性。四種細(xì)菌素殺菌作用明顯，接入四株菌的無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液5h后，分別可殺滅97.76％、97.67％、97.90％、97.67％的金黃色葡萄球菌ATCC25923。四株

8、菌的菌體細(xì)胞用0.1mol、L的NaCI(pH2.0)溶液處理后，KLDS1.0355和KLDS1.0373重新得到的上清液(含NaCl，pH6.5)對(duì)指示菌有抑制活性，說(shuō)明這兩株菌對(duì)自身產(chǎn)生的細(xì)菌素有一定的吸附作用，菌株KLDS1.0391和KLDS1.0364的處理液對(duì)指示菌沒(méi)有抑制作用，說(shuō)明這兩株菌對(duì)自身產(chǎn)生的細(xì)菌素沒(méi)有吸附作用。分離得到的四株菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和nisin相比，比活力較低，說(shuō)明細(xì)菌素的純度仍然不高，以后應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行細(xì)菌