植物乳桿菌ZJ316產(chǎn)細(xì)菌素遺傳性狀改造的初探.pdf

1、群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing，QS)是細(xì)胞濃度決定性網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，它調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)很多復(fù)雜的代謝過程。1970年，科學(xué)家在費(fèi)氏弧菌中首次揭示出了QS系統(tǒng)，隨后很多革蘭氏陽性菌與陰性菌的QS系統(tǒng)相繼被揭示。在近些年，隨著人們對(duì)QS系統(tǒng)研究的深入，人們也開始利用QS系統(tǒng)來為人類服務(wù)。
　　植物乳桿菌J316是一株具有良好抗菌活性的乳酸菌，與大多數(shù)乳酸菌一樣，其細(xì)菌素產(chǎn)生也是通過QS調(diào)節(jié)的。通過全基因組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Z

2、J316的QS系統(tǒng)缺少反饋調(diào)節(jié)因子plnC/plnD基因。因此我們希望對(duì)植物乳桿菌ZJ316的QS進(jìn)行改造，可以調(diào)控其細(xì)菌素的產(chǎn)量。
　　本實(shí)驗(yàn)已篩選得到了幾株抑菌效果較好的植物乳桿菌，通過提取其基因組，并以此為模板進(jìn)行PCR，確定目的基因plnC、plnD，并通過割膠回收獲得目的基因。對(duì)目的基因進(jìn)行雙酶切，連接質(zhì)粒PNZ8048，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒plnC-PNZ8048、plnD-PNZ8048，并保存于E.coli DH5α

3、中保存。
　　植物乳桿菌ZJ316作為野生菌，其電轉(zhuǎn)化條件并不明確，因此我們對(duì)植物乳桿菌J316電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至OD6001.1，用10g/L溶菌酶37℃處理細(xì)胞1h，使用甘油/蔗糖溶液作為電轉(zhuǎn)化緩沖液處理轉(zhuǎn)化效率最高。通過最優(yōu)條件，我們成功獲得了plnC-PNZ8048-ZJ316、plnD-PNZ8048-ZJ316基因工程菌。通過對(duì)基因工程菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不是很明顯，同

4、時(shí)也為基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)打下了一定的基礎(chǔ)。
　　基因工程菌的生長(zhǎng)曲線與野生菌相似，但它們的誘導(dǎo)表達(dá)條件還是有所不同，因此需要進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)誘導(dǎo)條件是在MRS液體培養(yǎng)基中加入15 ng/mL氯霉素，并在30℃培養(yǎng)，至OD6000.4加入2 ng/ml Nisin誘導(dǎo)16h，發(fā)現(xiàn)在27K Da附近出現(xiàn)了目的條帶。進(jìn)一步通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，plnC-PNZ8048-ZJ316對(duì)檸檬色葡萄球菌的抑制效果與野生菌并沒有明顯

5、的差別，plnD-PNZ8048-ZJ316對(duì)檸檬色葡萄球菌的抑制效果有明顯的下降。PlnC、PlnD作為一對(duì)反饋調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)菌素的產(chǎn)生，PlnC作為激活因子，并沒有對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生有明顯的激活作用，而PlnD卻展現(xiàn)出了其一定的抑制作用，基因工程表達(dá)雖然可以讓我們單獨(dú)研究PlnC、PlnD的作用，但是還是具有一定的缺陷，其表達(dá)產(chǎn)物或多或少會(huì)帶有多余的氨基酸序列，從而可能會(huì)影響目的蛋白的功能。
　　雖然我們初步確定了PlnC、

6、PlnD的功能，但是由于基因工程的缺陷，PlnC并沒有出現(xiàn)預(yù)想的結(jié)果，同時(shí)我們也未得到更高抑菌活性的植物乳桿菌。植物乳桿菌ZJQ的抑菌活性也具有不錯(cuò)的抑菌活性，因此我們希望可以通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，改造植物乳桿菌ZJ316。原生質(zhì)體融合技術(shù)是一種可以快速高效的改變微生物性狀的生物技術(shù)手段，它有著其他技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)，可以克服種間的不育性，使融合子同時(shí)具有雙親的優(yōu)良性狀。我們希望可以通過植物乳桿菌ZJ316與植物乳桿菌ZJQ進(jìn)行融合，獲