含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的病毒性傳染病。細(xì)菌DNA具有廣譜的免疫刺激作用,實(shí)驗(yàn)證明人工合成的CpG-ODN可以模擬細(xì)菌DNA誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1型免疫應(yīng)答。CpG-ODN作為一種新型的免疫佐劑已成為分子免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在本研究中,首先篩選出對(duì)豬

2、具有最強(qiáng)免疫刺激活性的CpG-ODN,將PRRSV ORF5基因克隆至哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體pVAX1,構(gòu)建了pVAX1-ORF5真核重組質(zhì)粒；將優(yōu)選的CpG-ODN插入到pVAX1-ORF5中,構(gòu)建成含有CpG基序的真核重組載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5。為了進(jìn)一步檢測(cè)其免疫原性,進(jìn)行SPF小鼠動(dòng)物試驗(yàn),檢測(cè)其免疫反應(yīng)指標(biāo)。用CpG-pVAX1-ORF5免疫仔豬,檢測(cè)對(duì)本體動(dòng)物的免疫保護(hù)效果。 1、不同序列的CpG-ODN

3、對(duì)豬體外周血淋巴細(xì)胞和脾臟免疫細(xì)胞免疫刺激作用的研究：為了篩選出對(duì)豬體有免疫刺激活性的CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN),人工設(shè)計(jì)合成了9種未甲基化CpG-ODN不同序列,分別作用于健康豬外周血淋巴細(xì)胞和脾臟免疫細(xì)胞,進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果和脾細(xì)胞的增殖能力和代謝能力,通過(guò)測(cè)得的OD490值,計(jì)算出淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(SI),篩選CpG-ODN的免疫刺激作用。結(jié)果顯示：九種不同序列

4、的CpG-ODN對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞和脾臟免疫細(xì)胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)效果最為明顯(SI=3.5),CpG-ODN6對(duì)豬脾臟免疫細(xì)胞的刺激指數(shù)最大(SI=2.7)。為研制豬DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐劑奠定了基礎(chǔ)。 2、含CpG序列PRRSV SD1 ORF5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)：本研究利用已構(gòu)建的PIRORF5S-ORF5重組質(zhì)粒,重新設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),將ORF5基因

5、插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAX1中,構(gòu)建出pVAX1-ORF5質(zhì)粒。再將CpG-ODN6和CpG-ODN7有機(jī)組合,人工設(shè)計(jì)合成CpG-ODN序列,通過(guò)在其兩端的粘性酶切末端定向插入到經(jīng)相同酶切處理的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ORF5,成功構(gòu)建含特定CpG序列的真核重組表達(dá)質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,經(jīng)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)證實(shí)CpG-pVAX1-ORF5可表達(dá)PRRSV GP5蛋白。構(gòu)建成功的表達(dá)PR

6、RSV GP5的DNA重組質(zhì)粒,為研究其所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的效果和強(qiáng)度以及對(duì)豬體產(chǎn)生的保護(hù)性反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 3、真核重組表達(dá)載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5免疫原性的研究：通過(guò)小鼠試驗(yàn)對(duì)CpG-pVAX1-ORF5真核重組表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行了免疫原性檢測(cè)。免疫體重約22-26克SPF小鼠,檢測(cè)體液免疫與細(xì)胞免疫水平。通過(guò)ELISA法檢測(cè)鼠血清中抗豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒抗體水平,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞的CD4+、C

7、D8+數(shù)值,用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(SI),試驗(yàn)結(jié)果表明:CpG-ODN能顯著提高鼠的特異性抗體滴度以及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。 4、真核重組表達(dá)載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5對(duì)豬體免疫作用研究：通過(guò)豬體試驗(yàn)對(duì)含CpG-pVAX1-ORF5 DNA疫苗進(jìn)行了免疫效力評(píng)價(jià)和病毒保護(hù)性試驗(yàn)。在豬體進(jìn)行了免疫試驗(yàn)。檢測(cè)豬PRRSV的特異性抗體滴度、IL-2水平以及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(MTT法)水平,并做了攻毒保護(hù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表