含有CpG基序的PRRSV ORF5基因的真核重組表達載體的構(gòu)建及其免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的病毒性傳染病。細菌DNA具有廣譜的免疫刺激作用,實驗證明人工合成的CpG-ODN可以模擬細菌DNA誘發(fā)機體產(chǎn)生強烈的Th1型免疫應(yīng)答。CpG-ODN作為一種新型的免疫佐劑已成為分子免疫學(xué)研究的熱點之一。在本研究中,首先篩選出對豬

2、具有最強免疫刺激活性的CpG-ODN,將PRRSV ORF5基因克隆至哺乳動物真核表達載體pVAX1,構(gòu)建了pVAX1-ORF5真核重組質(zhì)粒；將優(yōu)選的CpG-ODN插入到pVAX1-ORF5中,構(gòu)建成含有CpG基序的真核重組載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5。為了進一步檢測其免疫原性,進行SPF小鼠動物試驗,檢測其免疫反應(yīng)指標。用CpG-pVAX1-ORF5免疫仔豬,檢測對本體動物的免疫保護效果。 1、不同序列的CpG-ODN

3、對豬體外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞免疫刺激作用的研究：為了篩選出對豬體有免疫刺激活性的CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN),人工設(shè)計合成了9種未甲基化CpG-ODN不同序列,分別作用于健康豬外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞,進行體外轉(zhuǎn)化試驗。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化效果和脾細胞的增殖能力和代謝能力,通過測得的OD490值,計算出淋巴細胞增殖指數(shù)(SI),篩選CpG-ODN的免疫刺激作用。結(jié)果顯示：九種不同序列

4、的CpG-ODN對豬外周血淋巴細胞和脾臟免疫細胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7對淋巴細胞增殖能力的增強效果最為明顯(SI=3.5),CpG-ODN6對豬脾臟免疫細胞的刺激指數(shù)最大(SI=2.7)。為研制豬DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐劑奠定了基礎(chǔ)。 2、含CpG序列PRRSV SD1 ORF5基因真核表達載體的構(gòu)建與表達：本研究利用已構(gòu)建的PIRORF5S-ORF5重組質(zhì)粒,重新設(shè)計酶切位點,將ORF5基因

5、插入哺乳動物表達載體pVAX1中,構(gòu)建出pVAX1-ORF5質(zhì)粒。再將CpG-ODN6和CpG-ODN7有機組合,人工設(shè)計合成CpG-ODN序列,通過在其兩端的粘性酶切末端定向插入到經(jīng)相同酶切處理的真核表達質(zhì)粒pVAX1-ORF5,成功構(gòu)建含特定CpG序列的真核重組表達質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細胞,經(jīng)間接免疫熒光試驗(IFA)證實CpG-pVAX1-ORF5可表達PRRSV GP5蛋白。構(gòu)建成功的表達PR

6、RSV GP5的DNA重組質(zhì)粒,為研究其所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的效果和強度以及對豬體產(chǎn)生的保護性反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 3、真核重組表達載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5免疫原性的研究：通過小鼠試驗對CpG-pVAX1-ORF5真核重組表達載體質(zhì)粒進行了免疫原性檢測。免疫體重約22-26克SPF小鼠,檢測體液免疫與細胞免疫水平。通過ELISA法檢測鼠血清中抗豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒抗體水平,并用流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞的CD4+、C

7、D8+數(shù)值,用MTT法檢測淋巴細胞增殖指數(shù)(SI),試驗結(jié)果表明:CpG-ODN能顯著提高鼠的特異性抗體滴度以及淋巴細胞增殖反應(yīng)。 4、真核重組表達載體質(zhì)粒CpG-pVAX1-ORF5對豬體免疫作用研究：通過豬體試驗對含CpG-pVAX1-ORF5 DNA疫苗進行了免疫效力評價和病毒保護性試驗。在豬體進行了免疫試驗。檢測豬PRRSV的特異性抗體滴度、IL-2水平以及淋巴細胞增殖反應(yīng)(MTT法)水平,并做了攻毒保護試驗。試驗結(jié)果表