歐洲型PRRSV的分離與鑒定及其ORF5基因變異分析.pdf

1、豬生殖與呼吸綜合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS)是20世紀(jì)80年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病，引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙癥狀，以及各種年齡豬(特別是仔豬)的呼吸道癥狀，其病原為豬生殖與呼吸綜合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV)，屬于新成立的尼多病毒目(Nidovirales)

2、、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV基因組長約15kb，包括8個開放閱讀框架(ORFs)，ORFla和ORFlb編碼病毒復(fù)制酶，ORF2～5分別編碼病毒的糖蛋白GP2～GP5，ORF6編碼膜蛋白(M蛋白)，ORF7編碼保守性的核衣殼蛋白(N蛋白)。 PRRSV的GP5是該病毒最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有良好的抗原性，另外，ORF5是PRRSV基因變異最明顯的閱讀框。根據(jù)抗

3、原性不同將各地PRRSV分離株分為歐洲型(代表毒株為LV)和北美洲型(代表毒株為VR-2332)，前者主要流行于歐洲地區(qū)，后者主要流行于美洲和亞太地區(qū)。然而加拿大和美國研究人員于2000年分別在各自國家分離到類似LV的PRRSV。目前，已發(fā)表的中國大陸分離的PRRSV毒株均為美洲型。那么，中國大陸有沒有歐洲型PRRSV的感染呢?目前還未見系統(tǒng)的調(diào)查報告。本研究以實驗室現(xiàn)有的技術(shù)和材料為基礎(chǔ)，首先用肺泡巨嗜細(xì)胞和MARC-145細(xì)胞對疑似

4、患有PRRS的豬病料作病毒分離，并用特異性單克隆抗體鑒定分型，以確定中國是否存在歐洲型PRRSV。 首先用肺泡巨嗜細(xì)胞和MARC-145細(xì)胞從臨床診斷為PRRSV感染豬的血液，淋巴結(jié)等病料中分離到17株病毒，并用既能識別PRRSV歐洲株又能識別PRRSV美洲株單克隆抗體M1對分離的病毒進行鑒定，再用能特異識別PRRSV美洲株NSP2蛋白的單克隆抗體M2和能特異識別PRRSV歐洲株NSP2蛋白單克隆抗體M3對用M1鑒定為陽性的病毒

5、進行分型鑒定，結(jié)合熒光免疫技術(shù)證實共分離到17株P(guān)RRSV，其中有9株為歐洲型PRRSV，占分離毒株的52.9％。然后根據(jù)GeneBank中豬生殖與呼吸綜合征病毒歐洲毒株(LV株)基因序列分別設(shè)計合成了針對ORF5基因(含部分ORF4和ORF6基因)的引物，利用RT-PCR方法從9株歐洲型分離毒株細(xì)胞培養(yǎng)物中擴增出大小約830bp片段，克隆入pMD18-T載體后，送往寶生物工程技術(shù)有限公司測序。最后應(yīng)用DNAStar軟件對所測的基因序列

6、與國內(nèi)外已發(fā)表毒株的序列進行同源性比較，構(gòu)建基因進化樹，并對其推導(dǎo)氨基酸序列及預(yù)測蛋白的一些特性與國內(nèi)外已發(fā)表毒株進行比較。分析結(jié)果表明9株分離毒株與LV等歐洲型分離毒株親緣關(guān)系較近，推導(dǎo)氨基酸序列同源性在92％以上，尤其相似，可推斷分離的歐洲型毒株源于西班牙。 由研究結(jié)果可知目前中國大陸不僅存在歐洲型PRRSV，而且感染較為嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)引起養(yǎng)豬業(yè)重視。PRRSV歐洲型和美洲型抗原差異較大，僅有部分交叉保護，應(yīng)用根據(jù)美洲型毒株制備