高致病性PRRSV-HuN4株ORF3基因的真核表達(dá)及GP3單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒（Nidovirales）、動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus），能引起豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。1987年美國(guó)首次報(bào)道該病，不久此病迅速蔓延至北美和歐洲。1

2、996年我國(guó)首次分離到PRRSV，證明該病在我國(guó)的存在。2006年夏秋之季，我國(guó)南方大部分地區(qū)發(fā)生以高熱為特征的豬病，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)研究證實(shí)引起該病的主要病原為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic PRRSV）變異株。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，包括9個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open reading frames，ORFs）。PRRSVGP3是由ORF3基因編碼的一種高度糖基化糖

3、蛋白，在病毒的致病性、復(fù)制、裝配、變異和保護(hù)性反應(yīng)等方面可能具有重要意義。GP3是PRRSV各毒株之間變異性較高的蛋白之一，在病毒粒子中含量較少，其功能尚不明確。因此，本試驗(yàn)以HP-PRRSV HuN4株為研究對(duì)象，對(duì)GP3蛋白進(jìn)行了初步研究。
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表HP-PRRSV04uN4株）ORF3基因序列，經(jīng)序列分析去除其位于N端的（1～49aa）一部分疏水性區(qū)域，設(shè)計(jì)合成引物。將擴(kuò)增的基因克隆到pFastBa

4、e HTb桿狀病毒載體中，篩選的陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)移載體pF-ORF3轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)中，獲得重組表達(dá)載體rBac-ORF3。再將其轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rAc-ORF3，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)目的基因正確地插入到桿狀病毒基因組中。Western blot和IFA分析表明GP3在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中獲得正確表達(dá)，而且具有良好的反應(yīng)活性，重組蛋白分子量約27ku。
　　 將桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)并純化的GP3免疫5只6周齡的Bal

5、b/c雌性小鼠，按照常規(guī)方法制備單克隆抗體，同時(shí)用原核表達(dá)并純化的GP3建立間接ELISA方法進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)3輪篩選和克隆，獲得3株能夠穩(wěn)定分泌GP3特異性抗體的陽(yáng)性細(xì)胞克隆株，分別命名為1C7、2DI、4C6。用間接ELISA方法測(cè)得的1C7細(xì)胞上清抗體效價(jià)為1:256，腹水效價(jià)為1:12800:2D1細(xì)胞上清抗體效價(jià)為1:3×105.0，腹水效價(jià)為1:1.6×107.0；4C6細(xì)胞上清抗體效價(jià)為1:1024，腹水效價(jià)為1:25600