表達(dá)高致病性豬藍(lán)耳病病毒（HuN4株）GP5重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)也稱豬藍(lán)耳病，是由動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病，該病以引起母豬的繁殖障礙、仔豬和育成豬呼吸道癥狀及高死亡率為主要特征。自1987年首次發(fā)現(xiàn)以來，該病廣泛流行于世界各主要養(yǎng)

2、豬國家和地區(qū)，已成為威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。2006年以來，由該病毒變異株引起的高致病性豬藍(lán)耳病(Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome，HPPRRS)在我國廣泛流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。包括滅活苗和弱毒苗在內(nèi)的傳統(tǒng)PRRS疫苗對(duì)HPPRRS只能起到部分保護(hù)作用，因此研制針對(duì)HPPRRS的高效的疫苗顯得極為迫切。本實(shí)驗(yàn)室在研制HPPRRS常規(guī)疫苗的同時(shí)，也

3、開展了利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)HPPRRS病毒GP5的重組活載體疫苗，發(fā)揮此類疫苗多價(jià)并且可以作鑒別診斷的優(yōu)點(diǎn)，探索基因工程疫苗作為HPPRRS常規(guī)疫苗的補(bǔ)充，為防治HPPRRS的生物制品提供更多的選擇。 GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜糖蛋白，也是PRRSV重要的中和抗原，用含GP5基因的質(zhì)粒DNA進(jìn)行免疫，接種的豬產(chǎn)生了抗PRRSV的中和抗體，并可使接種豬在強(qiáng)毒攻擊后得到有效保護(hù)。GP5基因在不同PRRSV毒株之間遺傳變異較

4、大。為了更清晰地了解PRRSV的遺傳變異特征，本研究選取了PRRRSV的代表毒株和國內(nèi)高致病性豬藍(lán)耳病的代表株、及標(biāo)準(zhǔn)毒株HuN4株及其傳代毒的GP5序列進(jìn)行同源性分析及氨基酸序列比對(duì)。結(jié)果表明：本文分析的我國分離株為北美洲型，且與2006年后我國分離的其它高致病性豬藍(lán)耳病病毒GP5間存在較高的同源性，而與國內(nèi)經(jīng)典的流行毒株差異較大，且存在關(guān)鍵氨基酸的突變和一些規(guī)律性的點(diǎn)突變。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的以偽狂犬病毒Bartha-K61株為載體表

5、達(dá)PRRSVCH-1a株的GP5重組病毒，免疫豬后可以有效的抵抗PRRSVCH-1a株強(qiáng)毒的攻擊。但由于HPPRRS病毒的GP5與PKRSVCH-1a株GP5氨基酸的同源性只有93％，影響了該重組病毒對(duì)HPPRRS的保護(hù)效果。因此，本研究通過構(gòu)建表達(dá)HPPRRS病毒HuN4株GP5的重組偽狂犬病毒，為將來探討其是否能夠成為有效防制HPPRRS的疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究以經(jīng)典的偽狂犬弱毒疫苗Bartha-K61株為載體，構(gòu)建以增強(qiáng)型

6、綠色熒光蛋白(EGFP)為選擇標(biāo)記的表達(dá)HPPRRS病毒HuN4株GP5的重組偽狂犬病毒。構(gòu)建了含HPPRRS病毒GP5基因和EGFP報(bào)告基因的PRV轉(zhuǎn)移載體，經(jīng)酶切、PCR鑒定后為陽性的質(zhì)粒命名為pgG-HPGP5-EGFP。將該質(zhì)粒純化后，采用LipofectaminTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h后EGFP表達(dá)效率最高。利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒DNA和PRVBartha-k61株的基因組共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后60