TTMV ORF1基因的克隆表達及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、目的：確定上海地區(qū)TTMV的流行毒株，并設計特異性引物進行原核表達、純化，最終建立間接ELISA檢測方法，為臨床TTMV的診斷提供理論基礎。
　　方法：采用巢式PCR技術分別檢測TTMV4個型的陽性率，利用Mega4.0軟件和DNASTAR進行進化分析和同源比對，并繪制系統(tǒng)進化樹；將TTMV2型ORF1基因在大腸桿菌中進行原核表達，用Ni-NTA柱對表達產物進行純化，采用Western blot檢測并分析結果，并以此重組蛋白包被E

2、LISA板，通過反應條件的優(yōu)化，建立檢測TTMV血清抗體的間接ELISA方法，并利用該方法檢測臨床280份血清樣品。
　　結果：
　?。?）被檢的176份血液樣品中，TTMV2型感染率最高，達到14.2％,進行同源比對并繪制系統(tǒng)進化樹，確定TTMV2型AB038628和AB038626毒株為上海地區(qū)的流行毒株。
　　（2）TTMV2型 ORF1基因在大腸桿菌中以包涵體的形式進行了高效表達，表明該重組蛋白具有良好的反應原

3、性，能夠很好的識別TTMV抗體。
　?。?）建立的TTMV間接ELISA檢測方法，經重復性試驗、特異性試驗和靈敏性試驗結果顯示，該方法具有較好的可重復性；與TTV、HIV、人星狀病毒和人博卡病毒陽性抗體均無交叉反應。
　　結論：TTMV2型AB038628和AB038626毒株為上海的流行毒株,且2型ORF1基因的原核表達產物具有良好的反應原性，并將該重組蛋白作為抗原包被 ELISA板，建立了檢測TTMV的間接ELISA方法