姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米?？拱┗钚约澳孓D(zhuǎn)多藥耐藥研究.pdf

1、目的：
　　 目前，抗腫瘤藥物普遍存在藥物靶向性差和全身毒性問題，限制了藥物療效的發(fā)揮和長期使用。而且普遍存在的腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)也是治療失敗的主要原因。目前，體外逆轉(zhuǎn)MDR的藥物有很多，但是存在著體內(nèi)不穩(wěn)定，腫瘤靶點(diǎn)性差，毒副作用大等缺點(diǎn)。
　　 近年來國內(nèi)外學(xué)者開始從中藥中篩選提取低毒的可逆轉(zhuǎn)MDR的有效成分。姜黃素(curcumin，CUR)是常用中藥姜黃(curcum

2、a)中一個(gè)生物活性成分，具有多方面的藥理作用，被認(rèn)為是理想的抗癌化療藥物之一，具有逆轉(zhuǎn)MDR的作用。作為中藥逆轉(zhuǎn)劑又較其他化藥逆轉(zhuǎn)劑有很大的優(yōu)越性。但是姜黃素存在水溶性差，體內(nèi)吸收少、不穩(wěn)定，易降解等缺陷，因此限制了其應(yīng)用。
　　 生物納米載體的應(yīng)用不僅改善藥物的溶解度，提高藥物的生物利用度，而且還具有緩釋性，延長藥物體內(nèi)滯留時(shí)間和靶向性，從而降低藥物的毒性。
　　 本研究的目的就是基于生物納米載體的優(yōu)勢以及姜黃素的藥學(xué)

3、特點(diǎn)，篩選最佳的生物納米材料，制備載姜黃素的納米粒，并考察該納米粒的抗癌活性及對(duì)人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制，為制備高效、長效、靶向和低毒的姜黃素奠定基礎(chǔ)，為探索逆轉(zhuǎn)MDR提供一條思路。
　　 方法：
　　 (1)CUR-PBCA-NPs的制備及表征
　　 采用陰離子乳化聚合法制備CUR-PBCA-NPs，通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)CUR-PBCA-NPs的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，考察穩(wěn)定

4、劑的種類、反應(yīng)過程的pH值、單體的用量、穩(wěn)定劑的用量及藥物濃度對(duì)納米粒的粒徑、表面電位和包封率的影響，確定最佳制備工藝。
　　 透射電子顯微鏡和激光粒度分析儀分別對(duì)納米粒的外形、粒徑和表面電位進(jìn)行表征，紫外分光光度計(jì)和高效液相色譜的方法在420nm處測定藥物的載藥量和包封率，運(yùn)用體外動(dòng)態(tài)透析的方法研究了納米粒中姜黃素的體外釋藥。
　　 (2)體內(nèi)外抗癌活性及藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　 MTT法比較CUR-PBCA-NP

5、s、空白納米粒(PBCA-NPs)和游離姜黃素(CUR)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、Bel7402、Huh7和正常肝細(xì)胞L02存活率的影響，流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測不同濃度的載藥納米粒對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，western blotting方法比較了三者對(duì)HepG2細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase，COX-

6、2)表達(dá)的變化。
　　 建立裸鼠移植性肝癌動(dòng)物模型，尾靜脈注射PBCA-NPs、CUR-PBCA-NPs和生理鹽水后測定腫瘤大小，免疫組化法檢測腫瘤組織中的VEGF和COX-2蛋白的表達(dá)。通過測定SD大鼠尾靜脈注射CUR和CUR-PBCA-NPs后的血液中姜黃素的藥物濃度來比較其主要的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　 (3)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究
　　 選用人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR作為耐藥細(xì)胞模型。MTT法比

7、較CUR、CUR-PBCA-NPs和PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，流式細(xì)胞儀測定CUR-PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞周期及細(xì)胞攝取阿霉素的影響。Western blotting方法比較CUR、CUR-PBCA-NPs和PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrugresistance-associated protein

8、，MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancerresistance protein，ABCG2)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα亞型(TopoisomeraseⅡα，TopoⅡα)多藥耐藥蛋白的表達(dá)，對(duì)姜黃素納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 (4)阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒(DOX-CUR-PBCA-NPs)的研制及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用
　　 采取乳化聚合法制備DOX-CUR-PBCA-NPs復(fù)方

9、納米粒，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察姜黃素加入的時(shí)間、單體和殼聚糖的量、姜黃素和阿霉素的量對(duì)DOX-CUR-PBCA-NPs的粒徑、表面電位、載藥量和包封率的影響，確定最佳制備工藝。應(yīng)用透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、凝膠滲透色譜、示差掃描量熱法來表征DOX-CUR-PBCA-NPs，運(yùn)用體外動(dòng)態(tài)透析的方法研究了復(fù)方納米粒的體外釋放，MTT實(shí)驗(yàn)和western blotting方法研究姜黃素與阿霉素聯(lián)用的各種納米制劑及單一藥物納米制劑對(duì)MCF

10、-7/ADR的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)優(yōu)化的CUR-PBCA-NPs制備條件為：10mL反應(yīng)體系，pH為1.22，BCA選擇1.0％(V/V％)，殼聚糖選擇0.1％(W/V％)，姜黃素的加入量為1mg。制備的姜黃素納米粒的粒徑約為185±13.12nm，表面電位為+50.1±2.08mV，載藥量為1.078±0.05％，包封率為94.54±1.54％。制得的膠體溶液半年未發(fā)現(xiàn)有相分離和絮凝發(fā)生，其載藥納米粒

11、粒徑和分布無明顯變化。CUR-PBCA-NPs的體外釋藥符合雙相動(dòng)力學(xué)釋藥規(guī)律，前30min有50％的突釋，其余50％到第7天全部釋放出來。
　　 (2)CUR-PBCA-NPs的IC50(250ng/mL，以游離姜黃素計(jì)算)遠(yuǎn)小于游離姜黃素的IC50(15μg/mL)，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制呈時(shí)間和濃度依賴性。CUR-PBCA-NPs減少了游離姜黃素本身對(duì)正常肝細(xì)胞L02的殺傷，在對(duì)正常肝細(xì)胞殺傷不大的同時(shí)能有效地抑制肝癌細(xì)胞

12、的增殖。熒光顯微鏡、Annexin V-FITC/PI方法檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素納米粒處理后的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡和壞死狀態(tài)，細(xì)胞阻滯在G2/M期，與游離姜黃素呈現(xiàn)出相同周期的阻滯。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：姜黃素納米粒給藥組治療后的腫瘤體積的抑制率為56.46％，與生理鹽水對(duì)照組和空白納米粒對(duì)照組(抑制率約為7.69％)相比有顯著性差異(P<0.05％)。
　　 CUR-PBCA-NPs治療后使VEGF和COX-2在腫瘤組織的表達(dá)明顯減

13、少，腫瘤組織切片中COX-2和VEGF細(xì)胞染色為弱陽性，與強(qiáng)陽性的生理鹽水組和空白納米粒組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05％)。同樣，體外實(shí)驗(yàn)證明，20μg/mL CUR-PBCA-NPs(以納米粒的濃度計(jì)算)處理HepG2細(xì)胞48h后，比等量的游離姜黃素更能抑制血管生成，使COX-2和VEGF的表達(dá)下調(diào)增加。
　　 (3)通過SD大鼠尾靜脈注射姜黃素納米粒的水溶液和游離姜黃素藥物的生理鹽水溶液后，測定了不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，

14、比較得出，前者的平均滯留時(shí)間(MRT0-∞)比后者的長很多，表觀容積分布Vd是后者的51倍，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-∞約為后者的2倍，消除相消除半衰期(t1/2β)約為后者的52倍，說明姜黃素納米粒具有比游離姜黃素更長的血藥半衰期，生物利用度有了一定的提高，延長了姜黃素在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的滯留時(shí)間。
　　 (4)姜黃素納米粒相對(duì)于游離姜黃素的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)增強(qiáng)了近兩倍，10μg/mL DOX與陰性對(duì)照組對(duì)MCF-7/ADR的細(xì)胞周

15、期的影響無顯著性差異(F>0.05％)，而同時(shí)加入10μg/mL DOX與50μg/mLCUR-PBCA-NPs后，細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，同時(shí)加入40μg/mL的DOX與50μg/mL CUR-PBCA-NPs后，細(xì)胞則呈現(xiàn)S期阻滯。MCF-7/ADR經(jīng)50μg/mL CUR-PBCA-NPs與5、10、20μg/mL DOX同時(shí)處理后，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度明顯高于相對(duì)應(yīng)的阿霉素試驗(yàn)組。
　　 CUR-PBCA-NPs能有效

16、逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR中P-gp的表達(dá)，隨著孵育時(shí)間的遞增，表達(dá)明顯下降，處理5d時(shí)，P-gp的表達(dá)開始下降，到第7d時(shí)，就基本上檢測不到P-gp的表達(dá)了。MRP1的下調(diào)程度不大。但TopoⅡα和ABCG2蛋白的表達(dá)與陰性對(duì)照組的細(xì)胞相比沒有顯著性的差異。說明姜黃素納米粒逆轉(zhuǎn)MDR的機(jī)制可能是逆轉(zhuǎn)能量依賴性藥物轉(zhuǎn)出泵P-gp。
　　 (5)采用同樣的乳化聚合法制備DOX-CUR-PBCA-NPs復(fù)方納米粒，該納米粒平均粒徑為13

17、3±5.34nm，Zeta電位為+32.23±4.56mV，DOX和CUR的包封率分別為49.98±3.32％，94.52±3.14％。復(fù)方納米粒中姜黃素和阿霉素的體外釋放與單一藥物納米粒非常相似，說明兩種藥物共存并不影響各自的釋放。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果和WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，DOX-CUR-PBCA-NPs與CUR-PBCA-NPs+DOX-PBCA-NPs體外對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的生長抑制活性相當(dāng)，下調(diào)MCF-

18、7/ADR細(xì)胞中P-gp的表達(dá)也相當(dāng)，較沒有用PBCA納米粒包載的游離藥物、單一藥物的納米制劑及其他形式的制劑聯(lián)用的抗腫瘤活性及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的性能都顯著增強(qiáng)。說明利用PBCA納米粒同時(shí)包裹抗癌藥物阿霉素與中藥逆轉(zhuǎn)劑姜黃素協(xié)同用藥可以增強(qiáng)克服MDR的療效。
　　 結(jié)論：
　　 制備的這種帶正電荷的CUR-PBCA-NPs很好地保留且增強(qiáng)了姜黃素的抗癌活性和逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp介導(dǎo)的多藥耐藥。改善了姜黃素本身