羥丙基-β-環(huán)糊精修飾聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的研究.pdf

1、本課題采用現(xiàn)代靶向制劑新技術，選用羥基喜樹堿為模型藥物，以納米粒為載體，研制羥丙基-β-環(huán)糊精修飾聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒新型靶向給藥系統(tǒng)并進行動物體內分布及藥動學研究，探索抗腫瘤藥物靶向給藥治療的新方法、新思路、新技術，是藥劑學前沿領域的研究熱點，具有較高的科學技術價值和臨床應用前景。 羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin，HCPT)是從我國特有珙桐科早蓮屬落葉植物喜樹(Camptotheca acuminata

2、)中提取出來的一種生物堿，具有顯著的抗腫瘤活性及較寬的抗癌譜，且與其他常用的抗腫瘤藥無交叉耐藥性，可用于治療多種惡性腫瘤。HCPT作為抗腫瘤藥在臨床上被廣泛應用，對腹水性肝癌、頭頸癌、胃癌、膀胱癌等具有明顯療效，為我國最常使用的抗腫瘤植物藥之一。HCPT為水不溶性、脂難溶性藥物，臨床常用劑型為HCPT鈉鹽注射劑，但由于HCPT在體內代謝很快(t1/2=5min)，組織分布不理想以及內酯環(huán)不穩(wěn)定性均會阻礙其充分發(fā)揮抗腫瘤作用，限制了臨床應

3、用。因此采用靶向制劑技術，將HCPT制成納米制劑有望克服以上缺點，為HCPT的臨床應用開辟更廣闊的前景。 本課題以生物可降解型高分子材料氰基丙烯酸正丁酯為載體材料，研制羥丙基-β-環(huán)糊精修飾的羥基喜樹堿聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(HCPT-PBCA-NP)。在單因素考察的基礎上，通過均勻設計優(yōu)選處方及工藝，采用乳化聚合法制備納米粒，篩選最優(yōu)凍干保護劑進行冷凍干燥，采用MTT法考察體外抗腫瘤活性，建立可靠的含量測定方法及體內外質量評

4、價指標，研究納米粒在家兔體內的藥物動力學特征及小鼠體內組織分布特征，并就羥丙基-β-環(huán)糊精用量對納米粒性質的影響進行考察。主要研究結果如下： 1.以HCPT-PBCA-NP的形態(tài)和包封率為指標，固定處方中HCPT及羥丙基-β-環(huán)糊精用量，通過單因素試驗考察表面活性劑及穩(wěn)定劑種類、溫度、攪拌速度、攪拌時間、pH值、氰基丙烯酸正丁酯(BCA)用量及鹽類附加劑對納米粒性質的影響。根據(jù)單因素考察結果，選擇對納米粒性質影響最顯著的五個因素

5、作為考察對象，即單體BCA用量、穩(wěn)定劑Dxtran-70用量、乳化。乳化劑Pluronic F-68用量、附加劑NaHSO3用量及pH值，以包封率為指標，依照均勻試驗設計優(yōu)化、篩選處方與制備工藝。得最佳處方與工藝為：BCA用量為70μL，Dxtran-70用量為15mg，Pluronic F-68用量為15mg，NaHSO3用量為120mg，pH值為3.0，攪拌時間為3h，溫度為25℃。 2.對優(yōu)化所得HCPT-PBCA-NP的

6、理化性質及穩(wěn)定性進行綜合評價，所制備的納米粒在透射電鏡下觀察分散性好、圓整、均勻而不粘連，平均粒徑為137.4nm，Zeta電位為-20.37±0.92mV，包封率為(78.56±2.07)％，載藥量為(7.40±0.529)％，膠體pH值為4.96±0.079。HCPT-PBCA-NP膠體溶液在低溫(4℃左右)條件下穩(wěn)定性較好，而室溫(25℃左右)條件下穩(wěn)定性較差，長時間放置易出現(xiàn)沉淀，粒徑和包封率改變等不穩(wěn)定現(xiàn)象，因此需避光冷藏保存

7、。 3.為進一步增加HCPT-PBCA-NP膠體溶液的物理及化學穩(wěn)定性，延長貯存期，選擇以8％甘露醇和4％海藻糖合用作凍干保護劑，制備凍干制劑，并以其微觀形態(tài)，以及再分散后的粒徑大小、表面電位、包封率及載藥量為指標，對凍干效果進行評價。結果表明，與凍干前的HCPT-PBCA-NP膠體溶液相比，凍干復溶后粒子分布比較均勻，分散性較好，但稍有粘連；平均粒徑略有增大，由137.4nm增至169.7nm；Zeta電位由-20.37mV改

8、變至-22.59mV；包封率和載藥量均略有降低，分別由(78.56±2.17)％及(7.40±0.529)％降低至(72.83±3.42)％及(6.27±0.368)％。 4.采用熒光分光光度法進行生物樣品的測定。本方法靈敏度較高，重現(xiàn)性較好，線性范圍廣，且操作簡單，快速，準確，用此法測定家兔血漿、小鼠血漿及各組織臟器中HCPT濃度，計算藥動學參數(shù)，取得良好結果。為保證測定結果的準確性，在生物樣品處理過程中，應先加入冰醋酸避光酸

9、化，使開環(huán)的HCPT閉合成內酯形式，再用甲醇-乙腈(1:1)混合液沉淀蛋白提取藥物后測定熒光吸收強度F。血漿及各組織器官藥物濃度線性關系良好，回收率均在90％～110％內，日內精密度小于6％，日間精密度小于8％，且內源性物質不干擾HCPT的測定，可滿足生物樣品測定的要求。 5.家兔靜脈注射HCPT注射液和HCPT-PBCA-NP后，血藥濃度測定結果用DAS 2.0藥物動力學程序進行處理，兩者體內藥動學過程均符合雙室模型特征，動力

10、學方程分別為：C=0.582e-1.747+0.097e-0.306t和C=0.204e-0.464t±0.115e-0.044t。通過對兩種制劑靜脈注射給藥后的藥動學參數(shù)比較可知，納米粒組AUC值(2.805μg/mL*h)和t1/2β(15.712h)明顯高于注射液組AUC值(0.699μg/mL*h)和t1/2β(2.265h)；納米粒組藥物清除率CL(0.006L/h/kg)小于注射液組藥物清除率CL(0.026L/h/kg)。

11、證明：HCPT納米粒靜脈注射給藥后，可顯著延長藥物在體內的存留時間及藥物與靶組織器官的接觸時間，具有緩釋長效作用。 6.小鼠組織分布試驗表明HCPT制成納米粒后，與HCPT注射液相比，藥物在各組織器官的分布發(fā)生明顯改變，結果顯示：肝、脾的相對攝取率re分別為25.000和19.889：肝的總靶向效率Te由9.2l％提高到49.32％(5.36倍)，脾的總靶向效率Te由6.33％提高到26.98％(4.26倍)，而腎的總靶向效率則

12、由35.03％降至12.04％；肝臟內峰濃度提高至2.693倍，脾臟內峰濃度提高至4.816倍。表明該納米粒具有顯著的肝靶向性分布及較低的腎毒性。 7.通過考察羥丙基-β-環(huán)糊精用量對納米粒形態(tài)和粒徑分布、表面電位、包封率和載藥量、體外釋藥動力學及體外抗腫瘤活性等性質的影響，發(fā)現(xiàn)通過羥丙基-β-環(huán)糊精對納米粒進行表面修飾后可起到減小粒徑，降低表面負電性，提高包封率及載藥量，延緩藥物釋放速率，增強體外抗腫瘤活性的作用，且上述影響與

13、羥丙基-β-環(huán)糊精用量呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關系。以此為依據(jù)可進一步改善藥物療效、作用時間及組織器官靶向性。 8體外釋放試驗結果表明，游離HCPT的體外釋藥過程可用一級動力學方程描述，4h藥物已全部釋放出來；對于HCPT-PBCA-NP，羥丙基-β-環(huán)糊精用量越大，納米粒的緩釋長效作用越明顯。HCPT納米粒的體外釋放可用雙相動力學方程擬合，前期為快速釋藥，后期緩慢釋藥。這種釋藥特點比較符合抗腫瘤藥物的用藥原則，即給藥后到達靶部位可

14、快速釋放藥物，以達到較高藥物濃度發(fā)揮治療作用；慢速釋藥可不斷補充藥物到靶部位以維持有效藥物濃度，使制劑在較長時間發(fā)揮治療作用。 9.采用MTT比色法研究并比較HCPT-PBCA-NP及HCPT注射液對人肝癌細胞HepG-2體外生長及增殖的影響，評價體外抗腫瘤活性。結果表明，與HCPT注射液對照組相比，HCPT納米粒在體外可有效抑制人肝癌細胞HepG-2的生長增殖，并具有一定的劑量依賴性：隨著羥丙基-β-環(huán)糊精用量的增加，HCPT