hWNK4基因轉錄調控機制研究.pdf

1、前言：人類WNK4(Human With No lysine[K]kinase4,hWNK4)基因編碼一種特殊類型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,為WNK激酶(With No lysine[K]kinase,WNK)家族成員之一。由于該激酶家族成員在激酶結構域缺乏其它激酶高度保守的賴氨酸而得名。該賴氨酸在其它激酶參與錨定ATP的α和β磷酸基團和隨后的激酶磷酸化作用,但WNK激酶的賴氨酸被半胱氨酸所替代后激酶的生物活性并沒有發(fā)生改變。hWNK4

2、基因定位于17q21.31,基因組全長約16kb,含有19個外顯子,cDNA全長為3861bp,編碼1231個氨基酸。hWNK4基因的錯義突變可導致一種遺傳性高血壓——Ⅱ型假性低醛固酮血癥(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ,PHAⅡ,OMIM,No.145260),其主要臨床表現(xiàn)為高血壓和高血鉀。研究表明WNK4激酶主要表達在腎臟,通過調節(jié)腎臟遠曲小管和集合管上的多種離子轉運體和離子通道(如:Na-Cl共轉運體

3、[NaCl cotransporter,NCCT],腎外髓鉀離子通道[Renal OuterMedullary K+ Channel,ROMK],上皮鈉通道[Epithelial Sodium Channel,ENaC]等)參與機體水鹽代謝和血壓調節(jié)。目前關于hWNK4基因的研究主要集中在功能方面,而hWNK4基因表達調控機制以及上游調控因子仍不十分清楚。
　　 糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)在人體內主要由腎上

4、腺分泌,是一種重要的生理調節(jié)因子,它通過調節(jié)各種類型細胞內的基因表達行使其功能,在物質代謝、水鹽平衡調節(jié)、細胞增殖和分化方面發(fā)揮重要作用。在臨床,GC是最常用藥物之一,但長期使用易引起水鹽代謝紊亂,導致高血壓。所以本研究擬通過分析GC對hWNK4基因表達的影響和作用機制來鑒定hWNK4基因是否是GC引起水鹽代謝紊亂的一個作用靶點。
　　 真核生物基因的近端啟動子區(qū)(-250～+250)通常含有調節(jié)基因轉錄的重要順式作用元件。生物

5、信息學分析顯示hWNK4基因近端啟動子區(qū)無典型的TATA盒,但富含GC序列和一些潛在的轉錄因子作用元件,如Sp1、AP-1和C/EBP等。前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)hWNK4基因近端啟動子區(qū)一個關鍵的正性調控區(qū),因此本研究擬解析該正性調控區(qū)中所含的順式作用元件,從而進一步揭示hWNK4基因轉錄調控機制。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、人胚腎細胞系HEK293,非洲綠猴腎細胞系COS-7及細胞培養(yǎng)相關

6、試劑2、Northern雜交,Real-time RT-PCR及Western印跡雜交相關試劑3、基因克隆及熒光素酶報告基因檢測相關分子生物學試劑4、電泳泳動遷移實驗(EMSA),染色質免疫沉淀(ChIP),DNA蛋白結合分析實驗相關試劑5、糖皮質激素受體(Glucocortcoid receptor,GR)表達載體pRShGRα,Sp1表達載體pN3-Sp1,地塞米松(Dexamethasone,Dex,一種人工合成的GC),RU48

7、6(一種GR拮抗劑).
　　 二、實驗方法'1、Northern雜交檢測Dex刺激前后以及同時存在RU486情況下,HEK293細胞中hWNK4基因mRLNA表達變化;Real-time RT-PCR進一步驗證確認;
　　 2、克隆hWNK4基因啟動子序列(-484～+62),構建熒光素酶報告基因載體p484-1uc,轉染COS-7細胞,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析COS-7細胞中單獨轉染GR,或單獨Dex刺激,或轉染GR

8、同時以不同濃度Dex刺激對hWNK4基因啟動子活性的影響;
　　 3、生物信息學分析hWNK4基因啟動子結構基礎上,構建系列截短的hWNK4基因啟動子熒光素酶報告基因載體,轉染HEK293,通過雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析hWNK4基因各段啟動子活性;
　　 4、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析HEK293中Dex刺激前后以及同時存在RU486對hWNK4基因啟動子活性的影響;
　　 5、EMSA體外鑒定hWNK4基因啟

9、動子內激素反應元件及Dex對GR與該反應元件結合力的影響,ChIP體內實驗進一步驗證確認;
　　 6、對hWNK4基因近端啟動子-275～+62區(qū)域構建更為精細的系列截短的熒光素酶報告基因載體,轉染HEK293細胞,通過雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析,尋找hWNK4基因核心啟動子,并結合生物信息學分析確定對hWNK4基因基礎轉錄調控起關鍵作用的潛在順式作用元件;
　　 7、對確定的潛在Sp1作用元件進行定點突變,構建突變體熒

10、光素酶報告基因p241m-1uc,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析突變后啟動子活性變化,以確認其功能;
　　 8、DNA蛋白結合分析實驗體外鑒定Sp1作用元件,ChIP體內實驗進一步驗證確認;
　　 9、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析RNA干涉敲減Sp1或瞬時轉染過表達Sp1對hWNK4基因啟動子活性的影響,Western印跡雜交檢測Sp1表達水平;
　　 10、Real-time RT-PCR檢測RNA干涉敲減Sp1或瞬

11、時轉染過表達Sp1對內源hWNK4基因mRNA表達的影響。
　　 結果：
　　 1、Northern雜交和Real-time RT-PCR均顯示Dex刺激24h后,HEK293細胞中hWNK4基因mRNA表達下降為空白對照的28-35％,同時加入GR受體拮抗劑RU486可以使mRNA水平恢復至接近空白對照水平,提示Dex通過GR介導下調hWNK4基因表達。
　　 2、hWNK4基因啟動子報告基因p484-1uc轉

12、染COS-7細胞,熒光素酶活性分析顯示Dex呈GR依賴和劑量依賴方式抑制啟動子活性。
　　 3、生物信息學分析顯示hWNK4基因啟動子區(qū)無TATA盒,存在GR、Sp1、AP-1、GATA-1及C/EBP等多個潛在的轉錄因子作用元件;系列截短的hWNK4基因啟動子報告基因熒光素酶活性分析提示hWNK4基因啟動子區(qū)-337～-326和-285～-276為兩個負調控元件,-484～-337,-325～-285和-275～+62為三個正

13、調控區(qū);
　　 4、Dex單獨或Dex和RU486共同刺激后,雙熒光素酶活性分析表明hWNK4基因啟動子區(qū)-337～-326和-285～-276兩個負調控元件與GC的抑制作用密切相關。
　　 5、EMSA和ChIP實驗分別在體外和體內條件下證明GR結合到hWNK4基因啟動子-337～-326和-285～-276區(qū),并且Dex作用增強GR蛋白與這兩個位點的結合。
　　 6、熒光素酶報告基因表明hWNK4基因啟動子-

14、241～-202區(qū)域為核心啟動子;生物信息學分析顯示該區(qū)域存在一個潛在Sp1作用元件(-223～-214);
　　 7、突變Sp1作用元件(-223～-214)使hWNK4基因啟動子活性顯著下降;
　　 8、DNA蛋白結合分析實驗和ChIP實驗分別在體外和體內條件下證明-223～-214序列為Sp1作用元件。
　　 9、RNAi敲減Sp1,hWNK4基因啟動子活性降低;過表達Sp1,hWNK4基因啟動子活性升高;

15、
　　 10、RNAi敲減Sp1,內源hWNK4基因mRNA表達降低;過表達Sp1,內源hWNK4基因mRNA表達升高。
　　 結論：
　　 1、糖皮質激素下調hWNK4基因轉錄,該下調作用由hWNK4基因啟動子區(qū)的兩個負性糖皮質激素反應元件(-337～-326和-285～-276)介導。
　　 2、轉錄因子Sp1上調hWNK4基因轉錄,hWNK4基因啟動子-241～-202區(qū)域為核心啟動子,該區(qū)域內存在