APOBEC3G轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究目的： 1、研究上游激活轉(zhuǎn)錄因子1（upstream stimulatory transcription factor1，USF1）基因?qū)POBEC3G的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 2、研究HBV對APOBEC3G轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。 研究方法： 1、通過在線軟件對AOPBEC3G啟動子全長分析，尋找潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 2、pcDNA3．1（+）-USF1載體構(gòu)建：抽提HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成

2、cDNA，PCR擴(kuò)增USF1基因后連接到pMD18-T載體，以M13F和M13R為引物PCR鑒定有目的片段插入證明pMD-USF1載體構(gòu)建成功，測序并與UCSC數(shù)據(jù)庫序列比對正確無誤后抽提質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切連接到真核表達(dá)載體pcDNA3．1（+）上構(gòu)建pcDNA3．1（+）-USF1重組體，大量抽提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48小時后提取細(xì)胞總蛋白通過western blot鑒定其表達(dá)情況。 3、過表達(dá)USF1基因?qū)?/p>

3、A3G的影響：分別以pcDNA3．1（+）和pcDNA3．1（+）-UF1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時抽提細(xì)胞總RNA，用Real-time RT-PCR檢測APOBEC3G mRNA的變化；分別以pcDNA3．1（+）和pcDNA3．1（+）-SUF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，加入G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，抽提細(xì)胞總RNA，用Real-time RT-PCR檢測APOBEC3G mRNA，的變化。 4、降低USF1基

4、因表達(dá)對APOBEC3G的影響：合成USF1小干擾RNA片段瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時提取細(xì)胞總蛋白通過western blot檢測對USF1基因的干擾效果。提取細(xì)胞總RNA，用Real-time RT-PCR檢測APOBEC3G mRNA的變化。 5、利用雙報告基因系統(tǒng)檢測USF1基因?qū)POBEC3G啟動子的影響：pcDNA3．1（+）和pcDNA3．1（+）-UF1質(zhì)粒分別與pGL3-A3G載體共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞

5、和HepG2細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染過程中為平衡轉(zhuǎn)染效率，加入phRL-SV40質(zhì)粒作為內(nèi)參同時為了保證轉(zhuǎn)染的DNA分子數(shù)和質(zhì)量數(shù)一致，加用魚精DNA補(bǔ)足質(zhì)量。轉(zhuǎn)染后48小時裂解細(xì)胞檢測雙螢光素酶的活性，觀察在不同細(xì)胞中USF1基因?qū)POBEC3G啟動子的影響，保持轉(zhuǎn)染DNA總量以及pGL-A3G的量不變的情況下，采用不同劑量的pcDNA3．1（+）-USF1質(zhì)粒與pGL-A3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，觀察USF1基因?qū)POBEC3G啟動子影響

6、的劑量效應(yīng)。 6、確定USF1基因在APOBEC3G啟動子上的作用位點(diǎn)：對APOBEC3G啟動子全長進(jìn)行分析，根據(jù)APOBEC3G啟動子上E-box序列所在位置，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增一系列5’截短的APOBEC3G啟動子序列擴(kuò)增位點(diǎn)分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1130、-795、-232、-159、-84和-54處，酶切后連接到pGL3載體上，測序確認(rèn)與與GenBank登錄序列一致然后抽提質(zhì)粒分別與pcDNA3．1（+）和pcDNA

7、3．1（+）-SUF1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測雙螢光素酶的活性，確定在APOBEC3G啟動子上可能與USF1蛋白結(jié)合的E-box位點(diǎn)。 7、觀察USF1對定點(diǎn)突變E-box后的APOBEC3G啟動子影響：采用QuickChange定點(diǎn)突變試劑盒對APOBEC3G啟動子上-91/-86處的E-box進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其由CAGCTG序列變?yōu)镃AATTG，測序確認(rèn)突變成功后抽提質(zhì)粒酶切后重新與pG13載體連接，構(gòu)建成pGL3-A3

8、 Gmut重組載體，然后分別與pcDNA3．1（+）和pcDNA3．1（+）-SUF1質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染，同時將未突變的pGL3-A3G質(zhì)粒分別與pcDNA3．1（+）和pcDNA3．1（+）-SUF1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染作為陽性對照。檢測雙螢光素酶活性，觀察USF1基因是否能激活突變后的pGL-A3G載體螢光素酶表達(dá)。 8、研究HBV對APOBEC3G啟動子影響：將pUC19-1．24HBV載體與pGL3-A3G共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48小時

9、后裂解細(xì)胞檢測雙螢光素酶的活性，觀察HBV是否影響APOBEC3G啟動子活性。 9、HBV病毒蛋白對AOPBEC3G啟動子的影響：將編碼HBV病毒大S抗原、核心抗原、e抗原的真核表達(dá)載體與pGL3-A3G載體共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，檢測雙螢光素酶活性，觀察上述三種蛋白是否影響APOBEC3G啟動子活性。 10、HBV P基因RT區(qū)段重組腺病毒表達(dá)研究：采用PCR方法從pUC19-1．24HBV質(zhì)粒中擴(kuò)增RT/RNaseH區(qū)段

10、，將該片段與pCMV-Tag2載體連接構(gòu)建pCMV-tag-RT載體，隨后以pCMV-tag-RT載體為模板擴(kuò)增含有Flag標(biāo)簽的HBVRT區(qū)段基因酶切后與腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV連接，將其在Bj5183細(xì)菌中與腺病毒骨架載體重組，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Ad293細(xì)胞中包裝，待細(xì)胞裂解后收集含病毒的上清并感染Huh7細(xì)胞，48h后抽提細(xì)胞總RNA通過RT-PCR鑒定目的基因轉(zhuǎn)錄。 11、利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組HBV

11、聚合酶RT區(qū)段研究：采用PCR方法從pUC19-1．24HBV質(zhì)粒中擴(kuò)增RT/RNaseH區(qū)段，構(gòu)建含有HBV P基因RT區(qū)段的桿狀病毒穿梭載體pFastBacHT-RT，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10Bac與桿狀病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行重組，提取重組Bacmid DNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9獲得含有HBV P基因RT區(qū)段的重組桿狀病毒。重組的桿狀病毒再感染Sf9細(xì)胞48小時后收集細(xì)胞，利用針對載體自身攜帶的His標(biāo)簽的抗體通過Western blo

12、t檢測表達(dá)情況。 12、研究HBV P基因RT區(qū)段對APOBEC3G啟動子的影響：將pCMV tag-RT與pGL3-A3G載體共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，同時以pCMV-tag與pGL3-A3G共轉(zhuǎn)染做為陰性對照。轉(zhuǎn)染后48小時收集細(xì)胞，檢測雙螢光素酶活性。 13．用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD檢驗(yàn)，

13、P<0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、通過在線對APOBEC3G啟動子進(jìn)行分析結(jié)果顯示有大量潛在的的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，我們選擇USF1基因做為研究對象來進(jìn)行驗(yàn)證。 2、pcDNA3．1（+）-USF1載體構(gòu)建：經(jīng)過測序后與UCSC上的標(biāo)準(zhǔn)序列比對證明pMD-USF1序列是正確的。酶切以及PCR鑒定pcDNA3．1（+）-USF1載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后western blot可見在34KD處有明顯特異

14、條帶，證明我們所構(gòu)建的pcDNA3．1（+）-USF1載體可以表達(dá)USF1蛋白。 3、過表達(dá)USF1基因?qū)POBEC3G mRNA的影響：在瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3．1（+）-USF1基因的Huh7細(xì)胞中APOBEC3G的mRNA表達(dá)水平是轉(zhuǎn)染了pcDNA3．1（+）質(zhì)粒的對照組的兩倍左右。在穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3．1（+）-USF1的Huh7細(xì)胞系中APOBEC3G的mRNA水平是pcDNA3．1（+）對照組的1．7倍。

15、4、降低USF1基因表達(dá)對APOBEC3G的影響：通過轉(zhuǎn)染將USF1基因的小干擾RNA轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，western blot檢測USF1的表達(dá)顯示轉(zhuǎn)染了USF1小干擾RNA片段轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后USF1與對照組相比的表達(dá)降低，而做為內(nèi)參的GAPDH則基本一致。Real-time RT-PCR檢測結(jié)果顯示APOBEC3G的表達(dá)比對照組降低約30%。 5、USF1基因?qū)POBEC3G啟動子的影響：雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果

16、表明在Huh7和HepG2細(xì)胞中螢光素酶的活性與轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的對照組相比都可以升高約5倍（（t=-40．476，P=0．000；t=-42．960，P=0．000）。說明USF1基因在不同的肝細(xì)胞中均可以激活A(yù)POBEC3G啟動子的轉(zhuǎn)錄。不同量的USF1基因轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，螢光素的活性隨著USF1的表達(dá)增強(qiáng)而增強(qiáng)，提示USF1基因表達(dá)增強(qiáng)APOBEC3G啟動子活性也相應(yīng)的增強(qiáng)（F=204．750，P=0．000）。 6、確定USF

17、1基因在APOBEC3G啟動子上的作用位點(diǎn)：對APOBEC3G啟動子全長進(jìn)行分析顯示，APOBEC3G啟動子上共有四處E-box位點(diǎn)，分別位于-1439/-1434、-757/-752、-288/-283和-91/-86，PCR擴(kuò)增后通過酶切和測序鑒定證實(shí)一系列的5’端截短的APOBEC3G啟動子報告基因構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后檢測螢光素酶活性結(jié)果表明，隨著截短的片段越短，啟動子的活性越弱。轉(zhuǎn)染了USF1基因組與對照組相比較，當(dāng)截短