凋亡相關(guān)基因APR3轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、基因表達(dá)調(diào)控在機(jī)體適應(yīng)環(huán)境，個(gè)體發(fā)育分化，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等方面具有重要的生物學(xué)意義。真核生物的基因表達(dá)在基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后修飾，翻譯，翻譯后加工等水平受到嚴(yán)格精密的調(diào)控，研究基因的表達(dá)調(diào)控將為人類認(rèn)識(shí)自身和征服疾病提供重要的信息。在上述眾多的基因表達(dá)調(diào)控環(huán)節(jié)中，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o疑是基因表達(dá)的最基礎(chǔ)的調(diào)控點(diǎn)。 新基因APR3 是1999 年本研究室在研究全反式維甲酸誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化、凋亡時(shí)克隆得到的，因其可能參與了維甲酸誘

2、導(dǎo)的HL-60 的凋亡過程，故命名為凋亡相關(guān)基因3（apoptosis related protein 3）。該基因存在兩種轉(zhuǎn)錄本，編碼兩種不同的蛋白。目前，尚無(wú)關(guān)于該基因的功能報(bào)道，因此研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，有望為該基因參與的生物學(xué)功能提供有價(jià)值的線索。 本研究在全面分析現(xiàn)有的關(guān)于APR3 的信息的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了該基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的差異，通過PCR 擴(kuò)增該基因上游大約1000bp 的序列，并克隆到pGL3 載體中，根據(jù)熒光報(bào)

3、告系統(tǒng)讀數(shù)，結(jié)合RT-PCR 確定了該基因的啟動(dòng)子區(qū)；利用生物信息學(xué)手段，通過系列截短體的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFAT 對(duì)該基因有調(diào)控作用，并找到了相應(yīng)的順式作用元件，提示該基因可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)新基因APR3 可能受TNFα的下調(diào)。 具體來(lái)說，本研究的主要結(jié)論如下： 1. 與以往認(rèn)為的該基因的兩種轉(zhuǎn)錄本是通過基因的可變剪接生成的不同，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因5’上游調(diào)控區(qū)含有兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，通過系列

4、截短體的構(gòu)建，我們將兩個(gè)啟動(dòng)子定位于該基因的-245/-173 和-113/+148 處，分別負(fù)責(zé)兩種轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄。因此，和以往認(rèn)為的該基因兩轉(zhuǎn)錄本具有相同的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)不同，我們認(rèn)為該基因具有不同的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，不同引物RT-PCR 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的結(jié)果。 2. 以生物信息學(xué)為指導(dǎo)，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NFAT 和NFκB對(duì)目標(biāo)基因有調(diào)控作用；通過構(gòu)建系列截短體，我們發(fā)現(xiàn)-254/-113 含有轉(zhuǎn)錄因子NFAT 的結(jié)合位點(diǎn)，通過

5、突變體的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都是功能性的位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Rel 家族的另一主要成員NFκB/p65，與NFAT 不同，對(duì)目的基因有抑制作用。 綜上所述，我們的工作發(fā)現(xiàn)了APR3 基因的兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)負(fù)責(zé)該基因的轉(zhuǎn)錄，證明了重要轉(zhuǎn)錄因子NFAT和NFκB/p65 對(duì)該基因有明確的調(diào)節(jié)作用，預(yù)示著該基因可能參與NFAT 和NFκB/p65 相關(guān)的重要的生理或病理過程，為深入研究該基因的生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的信