耐甲氧西林金黃色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、隨著抗生素在臨床上長期、廣泛的使用,細菌耐藥性的出現(xiàn)及日益嚴重化給臨床抗感染治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。金黃色葡萄球菌是一種重要的條件致病菌,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)已成為全球院內(nèi)感染的首要病原菌,其多重耐藥菌株不斷涌現(xiàn),使得臨床治療變得更加困難。萬古霉素曾是治療MRSA感染的理想藥物,但隨著萬古霉素的廣泛應(yīng)用,已出現(xiàn)一些耐萬古霉素金黃色葡

2、萄球菌的報道,因而尋找新的治療方法十分必要。
　　 研究表明,MRSA耐藥機制包括靶位改變、鈍化酶產(chǎn)生、主動外排等。其中,抗生素作用靶位的改變是最主要的耐藥機制。通常,金葡菌細胞壁的肽聚糖合成是由一組稱為青霉素結(jié)合蛋白(Penicillin-binding proteins,PBPs)的蛋白酶系完成的,PBPs有轉(zhuǎn)糖基酶(glycosyltransferase,Tgase)和轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase,Tpase)2種

3、酶學活性,β-內(nèi)酰胺類抗生素能與PBPs的轉(zhuǎn)肽酶功能域(Tpase domain)選擇性結(jié)合,使其乙酰化而滅活Tpase活性,阻斷細菌肽聚糖合成,進而殺滅敏感菌。耐藥MRSA菌則從一種未知宿主中獲得了一mecA基因,編碼產(chǎn)生一種新的PBP,稱為PBP2a,其Tpase domain與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力極低,當正常PBPs被β-內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合而失去活性時,PBP2a能代替其功能,繼續(xù)肽聚糖合成,維持金葡菌的生長和成活。也就是說,

4、MRSA通過表達PBP2a,改變抗生素的作用靶點,參與MRSA的耐藥性表達。
　　 許多研究表明,在MRSA中,PBP2a是其高水平β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性所必須的。然而,PBP2a如何參與MRSA的耐藥性表達?有否相應(yīng)的共激活或抑制分子等調(diào)節(jié)因子存在?目前都不清楚。本研究中,我們將MRSA菌PBP2a Tpase domain克隆到pRBR載體上,構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒,利用細菌雙雜交系統(tǒng)(Bacterial two-hybnd sy

5、stem,B2H),從MRSA基因組表達文庫中篩選到了九個可能與PBP2a有相互作用的獵物多肽。隨后,利用體外Pull-down實驗驗證了其中一個獵物多肽P2與PBP2a的相互作用。
　　 本研究主要內(nèi)容和結(jié)果包括以下兩個部分:
　　 1.利用細菌雙雜交系統(tǒng)篩選PBP2a相互作用的蛋白:①以質(zhì)粒pMD-PBP2a(含有MRSA的PBP2a Tpase domain編碼序列)為模板,利用PCR擴增MRSA PBP2a蛋白的

6、Tpase編碼基因,經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切,克隆入pRBR質(zhì)粒載體中,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a,構(gòu)建了誘餌質(zhì)粒pBR-PBP2a,并進行PCR、限制性酶切和測序鑒定。②提取了MRSA基因組DNA,Sau3AI部分酶切后克隆入pRAC質(zhì)粒載體中,成功構(gòu)建了基因組文庫。隨機選取50個克隆,用位于pRAC質(zhì)粒多克隆位點兩側(cè)的測序引物進行菌落PCR擴增,檢測文庫插入片段的分布情況。所構(gòu)建的MRSA N315株基因組文庫覆蓋率達9倍,滿足后續(xù)

7、文庫篩選的需要。③將構(gòu)建正確的誘餌質(zhì)粒pBR-PBP2a與基因組文庫共轉(zhuǎn)化KS1細胞(其為染色體上整合有由λ操縱子控制的報告基因1acZ的報告菌株),接種于含50mg/ml X-gal,100μmol/L IPTG,100μg/ml AMP,50μg/ml Kan,34μg/ml C1的瓊脂平板培養(yǎng)后,挑取深藍色菌落進行LacZ活性檢測。同時以空質(zhì)粒pRAC轉(zhuǎn)化pBR-PBP2a/KS1細胞為陰性對照,以文獻報道的pACλCI-βfla

8、p(克隆了沙眼衣原體RNA聚合酶β亞單位的β-flap domain)轉(zhuǎn)化含pBRL28(克隆了沙眼衣原體CT663編碼基因)的KS1菌為陽性對照。④通過對200個克隆的LacZ活性檢測,將篩選到β-半乳糖苷酶活性明顯升高的克隆用B2H進行第二次雙雜交驗證,LacZ確實升高2倍以上者為獵物質(zhì)粒。一共獲得9個獵物克隆,分別將含有插入序列的pRAC質(zhì)粒分離并測序,并將9個克隆質(zhì)粒命名為pAC-p1～pAC-p9。⑤將9個插入序列用BLAST

9、I具進行序列比對,信息學分析表明它們均來自于MRSA N315基因組,插入片段最長者649 bp,最短者335bp,9個插入片段中含14個編碼基因,其中10個功能未知,1個編碼二氫吡啶二羧酸合酶、1個編碼二氫吡啶二羧酸還原酶,2個編碼染色體解離SMC蛋白。9個克隆中介導(dǎo)與PBP2a相互作用的多肽由14-46氨基酸組成。
　　 2.PBP2a與獵物多肽相互作用的再驗證:為證實B2H篩選到的獵物質(zhì)粒所編碼的蛋白與PBP2a Tpas

10、e domain確實存在相互作用,我們進行了獵物融合蛋白的表達、純化以及體外Pull-down PBP2a的實驗,具體包括①根據(jù)B2H檢測中β-半乳糖苷酶活性升高程度以及測序結(jié)果分析,選擇了pAC-p2質(zhì)粒中的插入片段進行深入探討。設(shè)計并合成一對引物,以質(zhì)粒pAC-p2為模板,PCR擴增了插入的p2序列,克隆入原核表達載體pGEX-6p-1中,構(gòu)建了pGEX-p2重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)。②對pGEX-p2/BL21重組菌進

11、行誘導(dǎo),表達目標融合蛋白,并對表達條件進行摸索,得到最適表達條件。③大量表達融合蛋白,利用GST-Sepharose4B免疫親和純化GST-多肽融合蛋白,得到可溶的純度較高的GST-多肽融合蛋白。同時對含GST基因的pGEX-6p-1空載體進行誘導(dǎo)表達,純化獲得GST蛋白,作為對照。④將GST融合蛋白固化在GST-Sepharose4B樹脂上,充當誘餌蛋白,通過蛋白間相互作用,捕獲了PBP2-2a蛋白(含有PBP2分子絞鏈區(qū)N-端與PB