耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性及其分型研究.pdf

1、背景與目的：
　　目前，在醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染中，金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）有著較高的分離率。且隨著內(nèi)酰胺類藥物的廣泛應(yīng)用，多重耐藥的金黃色葡萄球菌不斷涌現(xiàn)，最為嚴(yán)重的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）產(chǎn)生。自從1961年首例耐藥菌株被發(fā)現(xiàn)后，MRSA在世界各地均有所報(bào)道并呈顯著性增長趨勢。MRSA耐

2、藥譜極廣，幾乎可以水解所有的內(nèi)酰胺類藥物，且耐藥菌株傳播的速度很快?；诨颊吒腥韭屎筒∷缆矢?，醫(yī)療資源透支嚴(yán)重，病人、醫(yī)院以及社會都面臨沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且MRSA所致感染目前已成為世界上三大難解決感染性疾病之一，所以針對MRSA的研究也成為臨床微生物界的熱點(diǎn)。
　　基于MRSA的廣泛耐藥活性，及時(shí)明確菌株的耐藥譜，對于合理指導(dǎo)抗感染治療及嚴(yán)防耐藥菌株的產(chǎn)生與流行，具有重要價(jià)值。由于各地抗菌藥物使用習(xí)慣不同，不同地域MRSA菌株的

3、耐藥表型存在不同，故臨床抗菌藥物選擇上存在差異，此點(diǎn)也是MRSA研究內(nèi)容之一。萬古霉素是治療MRSA的重要手段。目前在河南地區(qū)尚未見到耐萬古霉素菌株的報(bào)道。但有研究表明，MRSA的萬古霉素MIC值有逐年增高趨勢。河南地區(qū)是否存在此種變化，MRSA與MSSA之間萬古霉素MIC是否有差異，對于臨床萬古霉素選擇以及劑量制定意義重大。目前，我省尚無此方面的研究報(bào)道。
　　資料顯示，MRSA的耐藥機(jī)制是由于MSSA獲得了SCCmec元件。S

4、CCmec為一可移動性的遺傳元件，其攜帶的mecA基因是導(dǎo)致MRSA耐藥性產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)。mecA基因通過編碼PBP2a而實(shí)現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥。研究表明，SCCmec元件有著多種型別，各型別之間因攜帶質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上定位耐藥基因不同，導(dǎo)致菌株耐藥表型存在差異。對 MRSA進(jìn)行分子分型，明確本地區(qū)流行SCCmec元件型別，是目前針對 MRSA研究的重要內(nèi)容，其研究結(jié)果，在抗感染治療中有著重要的指導(dǎo)價(jià)值。
　　為解決以上問題，我

5、們設(shè)計(jì)本課題。旨在通過對2013年8月-2014年7月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室分離的MRSA菌株檢測研究，闡明河南地區(qū)臨床分離MRSA菌株耐藥生物表型，探討MRSA與MSSA對萬古霉素MIC值的分析，完成對MRSA菌株的分子分型，最終反映河南地區(qū)分離耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀，為治療MRSA提供充分的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，便于臨床從根本上控制MRSA的感染與傳播。
　　方法：
　　1．菌株收集收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)菌室2

6、013年8月-2014年7月間，來自河南省不同地區(qū)的，門診及住院患者各類標(biāo)本分離出的非重復(fù)金黃色葡萄球菌325株。所有菌株均經(jīng)VITEK-II全自動微生物分析儀鑒定至種。
　　2．體外藥物敏感試驗(yàn)采用法國梅里埃藥物敏感試驗(yàn)鑒定板及 VITEK-II全自動微生物鑒定分析儀完成藥物敏感試驗(yàn)。特殊藥物采用 K-B紙片法完成。結(jié)果參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會2012版（Clinical and Laboratory Standards I

7、nstitute, CLSI2012）標(biāo)準(zhǔn)判斷。實(shí)驗(yàn)以ATCC25923菌株作為質(zhì)控菌株。
　　3．MRSA初篩試驗(yàn)以頭孢西丁藥敏紙片擴(kuò)散法作為MRSA的初篩試驗(yàn)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑≥22mm為MSSA，抑菌圈直徑≤21mm初篩為MRSA。
　　4．MRSA確證試驗(yàn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測mecA基因作為MRSA的確證試驗(yàn)，mecA基因陽性為判斷MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　5．萬古霉素MIC檢測采用E-Test試驗(yàn)完成

8、MRSA菌株萬古霉素MIC的檢測。
　　6．MRSA與MSSA MIC差異性分析實(shí)驗(yàn)菌株分為MRSA組與MSSA組，以不同的萬古霉素MIC濃度作為差異性分析的指標(biāo)，采用秩相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS17.0軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7．基因組DNA的提取使用溶菌酶對MRSA菌株進(jìn)行破壁處理后，嚴(yán)格按照磁珠法基因組DNA提取試劑盒操作流程，提取MRSA菌株基因組DNA，并采用紫外分光光度計(jì)檢測所

9、提DNA的濃度與純度。
　　8．SCCmec基因分型采用多重PCR技術(shù)進(jìn)行SCCmec基因分型。首先針對5種SCCmec基因型別保守片段設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，然后采用梯度PCR技術(shù)選擇合適的多重PCR退火溫度，之后對所有菌株進(jìn)行分型檢測。
　　9．pvl基因檢測采用梯度PCR技術(shù)明確pvl基因檢測最合適的退火溫度，之后采用普通PCR方法對所有的MRSA菌株進(jìn)行pvl基因的檢測。
　　10．SCCmec基因型與生物表型關(guān)系

10、分析選取不同SCCmec型別的MRSA菌株，進(jìn)行體外液體稀釋法抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，分析SCCmec基因型分型與抗生素體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1．所收集325株金黃色葡萄球菌主要來源于分泌物（39.4％），其次為痰液（31.7%）及血標(biāo)本（12.3%）。
　　2．325株金黃色葡萄球菌中，MRSA180株（55.4%），MSSA145株（44.6%）。從標(biāo)本來源看，MRSA主要來源依次為痰液（4

11、3.9%），分泌物（30.6%）及血標(biāo)本（10.6%）；從科室分布來看，MRSA主要來自于ICU（32.8%）、呼吸內(nèi)科（8.8%）、兒科（7.8%）、神經(jīng)外科（7.8%）。
　　3．藥敏結(jié)果顯示，MRSA菌株對內(nèi)酰胺類藥物高度耐藥，尤其對于青霉素及苯唑西林，耐藥率達(dá)到100%。非β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率也都超過50%。菌株對萬古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺、替考拉寧等藥物穩(wěn)定敏感。
　　4．MRSA菌株的耐藥率明顯高于MSSA菌

12、株，且兩種菌株對萬古霉素MIC值有顯著性差異，MRSA高于MSSA。
　　5．SCCmec分子分型結(jié)果顯示，所分離MRSA菌株中，SCCmecIII型為主要流行型別，共143株，占85.1%；其次為SCCmecII型12株，占7.1%；SCCmecV型較為少見，僅有3株，占1.7%；10株采用本實(shí)驗(yàn)方法未能進(jìn)行分型，占5.9%。
　　6．168株MRSA中pvl基因陽性菌株30株，占17.9%。
　　7．藥敏結(jié)果表明，

13、SCCmecⅡ型、SCCmecⅢ型除了對β-內(nèi)酰胺類藥物廣泛耐藥外，還對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素、四環(huán)素具有較高的抗藥活性；而SCCmecV型除β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥外，僅對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥；所有菌株均對呋喃妥因、萬古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺穩(wěn)定敏感。
　　結(jié)論：
　　1．MRSA來源標(biāo)本種類多，分布科室廣泛，且萬古霉素MIC值相對較高，提示臨床應(yīng)加強(qiáng)MRSA監(jiān)測與防控工作，避免菌株進(jìn)一步擴(kuò)散傳播。