甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌ccrAB的表達調控機制.pdf

1、金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是一種重要的人類和動物病原體細菌，能夠引起多種類型的感染性疾病，在臨床上主要通過使用抗生素來進行治療。然而隨著耐藥性菌株，特別是甲氧西林耐藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)的全球性傳播，抗生素治療遇到了前所未有的挑戰(zhàn)。由于獲得了能夠編碼PBP2a這種替代性青霉素結合蛋白的基因mecA，MRSA菌株對幾乎所有類型的β內酰胺類抗生素產生了抗性。基因mecA位于一個可移動的遺傳元件SCCmec上，該元件上同時也攜帶有編

2、碼一套整合酶的基因ccrAB或ccrC，它們編碼的Ccr整合酶參與了SCCmec的剪切和整合，而且ccrAB或ccrC的表達水平緊密關聯(lián)著SCCmec元件的穩(wěn)定性及其平行基因轉移。早期的研究發(fā)現ccrAB基因只在一小部分的細胞中有表達，而且其所占的比例或者ccrAB基因整體的表達水平可以明顯受到溫度和抗生素等外界因素的影響，說明在ccrAB基因的表達過程中存在著一套非常精細的調控過程，而關于這一調控機理的研究還是一片空白。
　　本

3、課題主要通過以下兩部分的研究對ccrAB表達的調控機制進行闡述，
　　1.輔助性sigma因子在ccrAB轉錄以及SCCmec剪切過程中的調控
　　輔助性sigma因子在金葡菌中介導了多種環(huán)境因子的感應以及細菌細胞生理過程的調控，早期的研究也發(fā)現SigH參與了金葡菌中原噬菌體基因組剪切和整合的調控。這些研究結果提示我們輔助性sigma因子也有可能參與調控了SCCmec元件的剪切和整合。在該研究中，我們首先確定了ccrA和cc

4、rB處于同一個操縱子中，而且它們的轉錄水平表現出了明顯的時相依賴性。我們分別在N315菌株中過表達了SigB，SigH，SigS三種輔助性sigma因子，結果顯示SigB的過表達明顯提高了ccrA基因的轉錄水平，進一步的研究也發(fā)現SigB的過表達能夠明顯提高SCCmec元件的剪切。通過引物延伸實驗和5'RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)我們鑒定出了一個之前從未被報道的SigB識別序列，而且該序列存在于多

5、種SCCmecⅡ型和Ⅳ型的菌株中。
　　2.反向重復序列以及蛋白調控因子SarS在ccrAB轉錄以及SCCmec剪切過程中的調控
　　在對N315菌株中ccrAB基因啟動子區(qū)域的序列分析過程中，我們發(fā)現了一段反向重復序列，進一步分析發(fā)現它廣泛存在于不同類型的攜帶ccrAB基因的SCCmec元件中，而且在堿基組成和相對于ccrA翻譯起始位點的位置上都非常保守。堿基替換相關的配對堿基可以明顯提高ccrAB基因啟動子的活性，而且無

6、論是替換反向重復序列的上游配對部分還是下游配對部分對ccrAB基因啟動子活性的影響基本一致，說明該段序列是通過一種特殊的空間結構來影響ccrAB的表達。此外，通過在N315基因組中直接替換該配對堿基或者通過在ccrAB過表達質粒中替換該部分堿基可以明顯影響SCCmec元件的穩(wěn)定性。以上結果說明反向重復序列在ccrAB基因的表達以及SCCmec元件的穩(wěn)定性方面起到了無可忽視的作用。通過DNApull-down的方法我們發(fā)現了一個可以特異性