耐甲氧西林金黃色葡萄球菌臨床分離株的分子分型及耐藥性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是院內(nèi)感染的主要病原菌之一,也是社區(qū)中引起皮膚和軟組織感染的常見(jiàn)原因。1961年Jevons在英國(guó)發(fā)現(xiàn)首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)感染后,MRSA便以驚人的速度在世界范圍內(nèi)蔓延,20世紀(jì)70年代后期已遍布世界各個(gè)角落,80年代末成為全球性病原微生物。在世界各地,曾多次出現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)MRSA

2、感染的暴發(fā)和流行,且一旦發(fā)生,往往迅速傳播,較難控制,導(dǎo)致發(fā)病率及病死率居高不下,給醫(yī)院和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
　　MRSA是醫(yī)院感染的重要病原菌,在醫(yī)院獲得感染的MRSA被稱(chēng)為醫(yī)院獲得性MRSA(hospital-acquiredMRSA,HA-MRSA),通常通過(guò)接觸傳播,感染年齡較大、免疫力低下、皮膚有傷口或于體外有管道相通的患者,健康人很少受到感染。然而近年來(lái)的研究顯示,一種新型的MRSA引起感染的比例呈逐年上升趨勢(shì),這種

3、新近流行的MRSA最早發(fā)現(xiàn)于1997年的美國(guó)紐約,其后多發(fā)生于社區(qū)環(huán)境中,通常感染無(wú)相關(guān)危險(xiǎn)因素的健康群體,被稱(chēng)為社區(qū)獲得性MRSA(community-acquiredMRSA,CA-MRSA)。
　　MRSA是金葡菌獲得了具有高度多態(tài)性的外源性葡萄球菌染色體盒(staphylococcalcassettechromosomemec,SCCmec)后形成的,HA-MRSA多攜帶I、II、III型SCCmec移動(dòng)元件,這幾型元件較

4、大,可攜帶多種耐藥基因,臨床上表現(xiàn)為多重耐藥。相對(duì)而言,IV和V型SCCmec元件多在CA-MRSA菌株之間傳播,元件片段較小,除mecA基因外較少攜帶其他耐藥基因。
　　目前,在全球范圍內(nèi),HA-MRSA主要由一些具有特定遺傳背景的克隆組成。在歐洲,德國(guó)、比利時(shí)主要為Iberian和SouthernGermany克隆,英國(guó)為EMRSA-16克隆。在亞洲,韓國(guó)、日本主要為NewYork/Japan克隆,而在印度及我國(guó)臺(tái)灣等地主要為

5、Brazilian/Hungarian克隆流行。CA-MRSA同樣存在一些主要的克隆。USA300是在世界范圍內(nèi),尤其是在美國(guó)流行最為廣泛的克隆,荷蘭主要為USA1000和USA300克隆,英國(guó)主要為EMRSA-15克隆,韓國(guó)以USA700克隆為主,我國(guó)香港主要為USA1100和USAl000克隆。這些情況表明MRSA的流行具有地理上的獨(dú)特性。
　　控制MRSA流行的重要策略在于明確其流行環(huán)節(jié)、切斷傳播途徑、終止耐藥菌株在人群中的

6、傳播。因而,檢測(cè)MRSA流行株的分子特征及耐藥譜對(duì)于鑒別菌株間的親緣關(guān)系、有效控制MRSA感染意義重大。本研究對(duì)2009年2月至2012年5月從北京、上海、重慶、廣州、沈陽(yáng)、烏魯木齊等6座城市的9所教學(xué)醫(yī)院收集的517株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)研究,鑒定出MRSA菌株,再綜合運(yùn)用MRSA分子分型方法,對(duì)所有MRSA菌株進(jìn)行分型分析。所得結(jié)果不僅可以豐富我國(guó)MRSA的分子流行病學(xué)資料,為MRSA感染的監(jiān)控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為我國(guó)其他地區(qū)MRS

7、A感染和流行的檢測(cè)提供借鑒。同時(shí)對(duì)MRSA菌株的抗生素耐藥譜進(jìn)行測(cè)定和分析,探討耐藥譜與菌株分子分型之間的關(guān)系,為研究MRSA的耐藥機(jī)制提供依據(jù),進(jìn)一步對(duì)指導(dǎo)臨床抗生素的合理應(yīng)用,減少抗生素的浪費(fèi),從根本上控制MRSA的感染和暴發(fā)流行有重要意義。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果包括以下三個(gè)部分:
　　1.MRSA的分子鑒定:應(yīng)用mecA-femB雙重PCR確認(rèn)MRSA。檢出MRSA309株,檢出率59.8％(309/517)。
　　2.M

8、RSA分子分型研究:①SCCmec基因分型:用PCR方法擴(kuò)增mec復(fù)合物及ccr復(fù)合物各基因組分,產(chǎn)物經(jīng)電泳成像后判斷其片段大小和組成,明確SCCmec基因型。結(jié)果309株MRSA菌株中SCCmecIII型178株、占57.6%,SCCmecII型68株、占22.0%,SCCmecIV型27株、占8.7%,SCCmecI型19株、占6.2%,SCCmecV型13株、占4.2%,未分型MRSA4株、占1.3%;②葡萄球菌A蛋白基因多態(tài)性分

9、析(spa):PCR方法擴(kuò)增葡萄球菌的表面蛋白SPA基因的X區(qū),并進(jìn)行核苷酸測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ridom.de/spaserver)中公布的堿基重復(fù)序列進(jìn)行比較,根據(jù)排列方式及重復(fù)次數(shù)確定MRSA的spa型別。結(jié)果309株MRSA菌可分為31個(gè)spa基因型,其中優(yōu)勢(shì)型別為t030型(90株,占29.1%)、t002型(49株,占15.9%)、t037型(48株,15.5%),另外發(fā)現(xiàn)新的spa基因型7株;③

10、多位點(diǎn)序列分型(MLST):以金葡菌的7個(gè)管家基因(arc,aroE,glpF,gmk,pta,tpiandyqiL)的PCR擴(kuò)增片段序列分析為基礎(chǔ),產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行雙向測(cè)序,直接將結(jié)果提交數(shù)據(jù)庫(kù)(http://saureus.mlst.net/)進(jìn)行比較,比較每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因,獲得序列號(hào)(ST),與已知的MRSA流行株進(jìn)行比較和分析。309株MRSA菌可分為15個(gè)ST型,優(yōu)勢(shì)型別為ST239型(159株,51.5%)、ST5型

11、(78株,占25.2%)、ST59型(33株,10.7%),另外發(fā)現(xiàn)新的ST型4株;④脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型(PFGE):新鮮培養(yǎng)的MRSA包埋于瓊脂中,經(jīng)過(guò)破壁、原位消化、酶切、電泳、染色和紫外成像后,所得結(jié)果用軟件BioNumericsversion6.6(AppliedMaths)進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果309株MRSA分為23個(gè)聚類(lèi)組,依次命名為A-W型。包括17個(gè)大聚類(lèi)組、6個(gè)小聚類(lèi)組以及37個(gè)偶發(fā)株。其中E型、I型、L型和M型為主要型

12、別,分別占9.7%(30/309)、10.0%(31/309)、12.9%(40/309)和7.8%(24/309);⑤殺白細(xì)胞毒素(PVL)毒力基因檢測(cè):PCR方法擴(kuò)增特征基因。76株MRSA擴(kuò)增條帶顯示pvl基因陽(yáng)性,陽(yáng)性率為24.6%。
　　3.MRSA的藥敏試驗(yàn):采用BioFosun微生物鑒定藥敏分析儀檢測(cè)MRSA對(duì)17種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥率最高,如對(duì)苯唑西林的耐藥率為97.6%,對(duì)青霉素的

13、耐藥率為100%,對(duì)氨芐西林的耐藥率為99.4%。同時(shí),對(duì)多種非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素也有較高的耐藥率,如對(duì)慶大霉素的耐藥率為77.3%,對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥率為80.2%,對(duì)克林霉素的耐藥率為80.9%,對(duì)紅霉素的耐藥率為86.2%以及對(duì)左氧氟沙星的耐藥率為81.7%。如果將某一菌株對(duì)3種以上非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥定義為多重耐藥菌株,則檢測(cè)的結(jié)果顯示74.8%(231/309)的MRSA株是多重耐藥菌株。
　　綜上所述,分子流行病學(xué)檢

14、測(cè)顯示我國(guó)MRSA并非以單一克隆占優(yōu)勢(shì),主要由3種克隆(ST239-MRSA-III-t030、ST5-MRSA-II-t002和ST239-MRSA-III-t037)構(gòu)成,并且呈交替流行趨勢(shì)。除了上述流行優(yōu)勢(shì)克隆外,另外發(fā)現(xiàn)6個(gè)小規(guī)模的克隆在中國(guó)局部地區(qū)流行,如在重慶流行的ST239-MRSA-III-t138(3.6%,11/309),在廣州流行的ST45-MRSA-III-t1081(3.6%,11/309)和ST59-MRSA

15、-I-t437(2.6%,8/309),主要在沈陽(yáng)流行的ST5-MRSA-II-t570(46.4%,13/28),以及在重慶和廣州流行的ST59-MRSA-IV-t437(3.6%,11/309)和ST59-MRSA-V-t437(1.6%,5/309)。本研究結(jié)果同時(shí)提示不同地區(qū)的MRSA優(yōu)勢(shì)流行克隆對(duì)抗生素的耐藥譜(定義耐藥率大于70%的非β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素組成不同型別MRSA耐藥譜)不盡相同,北京、廣州和烏魯木齊流行的ST239

16、-MRSA-III-t030克隆有耐藥譜GEN/CIP/RIF/LVX,重慶的流行克隆ST239-MRSA-III-t037和上海的流行克隆ST5-MRSA-II-t002有相同的耐藥譜GEN/CIP/CLI/ERY/TET/LVX/SXT,沈陽(yáng)的流行克隆ST5-MRSA-II-t570有耐藥譜GEN/CIP/CLI/ERY/TET/LVX。MRSA流行的地理特性和對(duì)抗生素的多重耐藥提示對(duì)MRSA長(zhǎng)期的進(jìn)化和耐藥問(wèn)題需要進(jìn)行長(zhǎng)期的多中心