SELEX技術(shù)篩選甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌適配子.pdf

1、目的：
　　利用SELEX技術(shù)篩選與甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，為建立MRSA快速診斷的新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）為臨床分離株，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA），為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品菌株；體外合成一個(gè)含35個(gè)核苷酸隨機(jī)序列總長(zhǎng)81nt庫(kù)容量大約為1015-16的ssDNA文庫(kù)；優(yōu)化PCR反應(yīng)條件；用生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增dsDNA，生物

2、素鏈霉親和素磁珠分離方法構(gòu)建ssDNA文庫(kù)；ssDNA文庫(kù)先與MSSA結(jié)合，反篩除去與其結(jié)合的ssDNA，然后與MRSA結(jié)合，洗脫與其結(jié)合的ssDNA，構(gòu)建次級(jí)ssDNA文庫(kù)進(jìn)行下一次篩選。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每輪反篩，正篩后的ssDNA文庫(kù)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察每輪篩選結(jié)果。將最后一輪篩選后得到的ssDNA用測(cè)序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中克隆和測(cè)序。應(yīng)用DNA MAN軟件和RNA structer軟件

3、對(duì)每一個(gè)適配子的保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。體外合成FITC標(biāo)記的適配子，利用熒光顯微技術(shù)及PCR方法鑒定其與MRSA結(jié)合的特異性。
　　結(jié)果：
　　在SELEX篩選過(guò)程中，隨著篩選輪數(shù)的增加，ssDNA與MRSA的特異性逐漸增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)20輪篩選后，隨機(jī)文庫(kù)中的ssDNA幾乎不再與MSSA結(jié)合，而與MRSA結(jié)合的ssDNA得到了富集和進(jìn)化，說(shuō)明得到的寡核苷酸適配子可以特異性的與MRSA結(jié)合。將最后一輪篩選后得到的ssDNA用

4、測(cè)序引物PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中克隆和測(cè)序，挑選了35個(gè)克隆，成功測(cè)出30個(gè)序列，根據(jù)測(cè)序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)所有的適配子的一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有共同的同源序列，但可以分為8個(gè)家族：家族1含有保守序列ACCCCGACTCGGTTAATACAAAT，家族2含有保守序列 GGTTTTTT，家族3含有保守序列ACCTCG，家族4含有保守序列 AAATGG，家族5含有保守序列 TTGTGT，家族6含有保守序列GGTGGTGT，家族7含有保守序列GATT

5、TACTT，家族8共4個(gè)保守序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，適配子主要形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)特征可能是適配子與MRSA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。人工合成7號(hào)適配子，進(jìn)行特異性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能特異性結(jié)合MRSA，而不與MSSA、MRSCN、MSSCN大腸桿菌結(jié)合，說(shuō)明7號(hào)適配子能特異性的與MRSA結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　本研究建立起以MRSA為靶點(diǎn)的SELEX篩選的平臺(tái)，獲得與MRSA特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，為建立快速檢測(cè)MRSA感染的新方