藍(lán)光對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺滅作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus， MRSA）感染是引起創(chuàng)傷病人創(chuàng)面不愈、甚至死亡的重要原因，且 MRSA具有高度耐藥性，臨床抗MRSA治療面臨重大挑戰(zhàn)?？股氐氖褂檬荕RSA出現(xiàn)的最主要因素，尤其是抗生素的濫用。目前，針對(duì) MRSA的治療，臨床指南推薦恰當(dāng)抗生素、恰當(dāng)劑量、早期治療?？股厥褂帽夭豢缮?，但卻容易引起MRSA更大程

2、度耐藥，很多國家報(bào)道 MRSA對(duì)萬古霉素出現(xiàn)不同程度耐藥，甚至完全耐藥。20世紀(jì)70年代，Costerton等提出了細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm,BF）的概念并指出許多細(xì)菌以生物膜形式廣泛存在于自然界中。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌的重要生存方式，是細(xì)菌耐藥性形成的重要機(jī)制之一。在世界范圍內(nèi)，中國是MRSA檢出率較高的國家。因此開發(fā)新的MRSA治療策略迫在眉睫。其中藍(lán)光輻照技術(shù)抗菌療法是近幾年出現(xiàn)的最具有前景的治療方法之一。本實(shí)驗(yàn)

3、旨在通過體外及在體實(shí)驗(yàn)研究藍(lán)光以不同能量作用于 MRSA及其生物膜，并觀察分析其抗菌效果，為臨床創(chuàng)傷病人 MRSA感染治療提供有力工具，并可給其他耐藥菌感染藍(lán)光治療提供新的研究思路。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)主要通過以下三個(gè)方面研究藍(lán)光對(duì)MRSA的殺滅作用：
　　1．藍(lán)光抗游離狀態(tài)MRSA的實(shí)驗(yàn)研究：
　　本實(shí)驗(yàn)所選 MRSA菌株采集于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海第三人民醫(yī)院燒傷整形科，采用法國生物梅里埃公司AT

4、B細(xì)菌鑒定儀鑒定。采用12 J/cm2、60 J/cm2、120 J/cm2、240 J/cm2的藍(lán)光照射細(xì)菌，分別與非處理組（對(duì)照組）及紅光照射組相比較；將照射后細(xì)菌分別采用平板劃線、菌落計(jì)數(shù)、活/死（LIVE/DEAD）菌染色法評(píng)價(jià)藍(lán)光殺菌效果。
　　2.藍(lán)光抗生物膜內(nèi)MRSA的實(shí)驗(yàn)研究：
　　挑取上述菌株，于蓋玻片上完成 MRSA生物膜的培養(yǎng)。根據(jù)游離菌結(jié)果提示，選用120J/cm2、240J/cm2和360J/cm2

5、藍(lán)光進(jìn)行照射，殺菌效果的評(píng)價(jià)：1.采用活/死（LIVE/DEAD）菌染色，并于激光共聚焦顯微鏡下觀察；2.電鏡下觀察細(xì)菌死亡及生物膜破壞情況。
　　3.藍(lán)光抗創(chuàng)面MRSA感染的實(shí)驗(yàn)研究：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)我們選用具有生物發(fā)光功能的MRSA（ATCC33591）菌株。48只C57BL/6小鼠分對(duì)照組和干擾組，全部制作背部皮膚全層缺損創(chuàng)傷模型，大小為2 cm*2cm，于筋膜下注射菌量1*1010 CFU。對(duì)照組不予任何處理，干擾組采

6、用120 J/cm2藍(lán)光分別于傷后第0~7天進(jìn)行照射。通過Fusion FX7圖像掃描分析系統(tǒng)分析藍(lán)光抗菌效果；皮膚病理切片蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosinstaining HE染色）了解干擾組及對(duì)照組炎性細(xì)胞浸潤情況；用圖像分析軟件計(jì)算不同時(shí)相點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率。
　　研究結(jié)果：
　　1.藍(lán)光抗游離狀態(tài)MRSA的實(shí)驗(yàn)研究：與對(duì)照組及紅光照射組相比，60 J/cm2及以上劑量組藍(lán)光照射具有明顯殺菌效果（P均

7、<0.01），呈劑量效應(yīng)關(guān)系；紅光照射組與對(duì)照組相比無明顯差異，無殺菌作用。
　　2.藍(lán)光抗生物膜內(nèi)MRSA的實(shí)驗(yàn)研究：240 J/cm2能量密度的藍(lán)光亦能有效殺滅MRSA生物膜內(nèi)的細(xì)菌，破壞生物膜的形成。
　　3.藍(lán)光抗創(chuàng)面MRSA感染的實(shí)驗(yàn)研究：與對(duì)照組相比，經(jīng)藍(lán)光連續(xù)6.0±0.9天照射后，實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面感染得到有效控制，大部分MRSA被殺滅；皮膚HE切片顯示，在傷后早期兩組炎性細(xì)胞浸潤情況無明顯差別，隨著干擾組創(chuàng)面感