小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中磷酸化JNK表達(dá)及其與損傷時間相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：皮膚損傷愈合是一個復(fù)雜的過程，包括血液成分凝集、炎癥、肉芽組織形成、新生上皮覆蓋、結(jié)締組織收縮和纖維化等過程。c—Jun氨基末端激酶(c—Jun N-Terminal kinase/stress—activated protein kinase，JNK/SAPK)為絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase，MAPK)家族的一個重要的亞族，可通過細(xì)胞性壓力和炎癥刺激發(fā)生磷酸化而激活，與重

2、要的細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，比如炎性反應(yīng)和凋亡。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)，檢測小鼠皮膚損傷區(qū)切創(chuàng)后各時間段磷酸化JNK(phospho—JNK，p—JNK)的變化情況，探討p—JNK在皮膚損傷愈合中的作用及其在損傷時間推斷上應(yīng)用的可能性。 方法：健康成年(8周齡)清潔級昆明系小鼠55只，雌雄不限，體質(zhì)量35～40g，隨機分為11組。其中皮膚切創(chuàng)分為10個時間段組，另一組為正常對照組，每組均為5只小鼠。乙醚氣體吸

3、入麻醉，背部剪毛處理后，常規(guī)手術(shù)消毒，在背部中央做一縱行長1.5cm皮膚全層切口，深達(dá)筋膜。分別于傷后0h、3h、6h、12h、1d、3d、Sd、7d、10d和14d將小鼠脫頸椎處死，取傷口處1.5cm×1.0cm皮膚組織。正常對照組小鼠麻醉后背部剪毛，不做切創(chuàng)，觀察至14d，脫頸椎處死，取相同部位同等大小皮膚，以備HE染色、免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測應(yīng)用。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)檢測55例小鼠

4、皮膚切創(chuàng)后各時間段p—JNK變化情況，以非切創(chuàng)小鼠皮膚組織作對照，顯微鏡×400倍下，在損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機選取10個視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞率。應(yīng)用Fluochem V2.0軟件檢測各時間段的平均灰度值，測得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。用SPSS13.0 for Windows進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：正常對照組小鼠皮膚的表皮、毛囊及皮脂腺中表達(dá)p—JNK。皮膚切創(chuàng)傷

5、后6h，可見少數(shù)多核粒細(xì)胞有p—JNK表達(dá)。傷后12～24h，大量浸潤的多核粒細(xì)胞和部分單個核細(xì)胞p—JNK呈陽性。傷后1～3d隨著時間的延長，p—JNK陽性細(xì)胞主要以單個核細(xì)胞為主。傷后5～14d p—JNK表達(dá)主要在成纖維細(xì)胞中。傷后0～3h，p—JNK陽性細(xì)胞率較低，隨著傷后時間的延長，p—JNK陽性細(xì)胞率逐漸增加，1d達(dá)到高峰。傷后3～5d一直呈高表達(dá)狀態(tài)。傷后7d p—JNK陽性細(xì)胞率達(dá)到第二峰，隨后逐漸下降。除傷后3d與5d

6、陽性細(xì)胞率無統(tǒng)計學(xué)差異外(P>0.05)，其他各組與相鄰上組的細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示正常對照皮膚內(nèi)有p—JNK陽性條帶。皮膚切創(chuàng)傷后各時間段組p—JNK表達(dá)強度有一定規(guī)律。傷后0～12h，陽性條帶逐漸增強；1d，稍有下降；3d，p—JNK達(dá)到高峰。傷后5d、10d，較少；但傷后7d p—JNK相對較深。到傷后14d p—JNK陽性條帶基本與正常對照組條帶情況一致。除0h與