小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中M-,3-型膽堿能受體表達(dá)及其與損傷時(shí)間相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：
　　 皮膚損傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括血液成分凝集、炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、新生上皮覆蓋、結(jié)締組織收縮和纖維化等過程。迷走神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿可被非神經(jīng)細(xì)胞（如角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞等）合成并通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌等方式參與皮膚的許多基本功能，如增殖、分化、粘附和遷移，微循環(huán)，血管發(fā)生及許多免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，參與皮膚損傷愈合的中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等均發(fā)現(xiàn)非神經(jīng)膽堿能

2、系統(tǒng)或其組成成分。M3R（M3 subtypes of muscarinic receptor）是毒蕈堿乙酰膽堿受體的一個(gè)亞型，以往的研究表明M3R參與炎癥反應(yīng)和組織器官纖維化等。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)，檢測小鼠皮膚切創(chuàng)后損傷區(qū)及周邊區(qū)各時(shí)間段M3R的表達(dá)情況，探討M3R在皮膚損傷愈合中的作用及其在損傷時(shí)間推斷上應(yīng)用的可能性。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 健康成年清潔級(jí)昆明小鼠50只，雌雄

3、不限，體重35～40g，隨機(jī)分為10組。其中9組為皮膚切創(chuàng)組，另一組為正常對(duì)照組，每組均為5只小鼠。乙醚氣體吸入麻醉，背部剪毛處理后，常規(guī)手術(shù)消毒，在背部中央做一縱行長1.5cm皮膚全層切口，深達(dá)筋膜。分別于傷后0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d將小鼠麻醉后脫頸椎處死，取傷口處1.5㎝x1.0cm皮膚組織；正常對(duì)照組小鼠麻醉后背部剪毛，不做切創(chuàng)，觀察14d，脫頸椎處死，取相同部位同等大小皮膚。以各HE染色、免疫組

4、織化學(xué)染色和Western blot檢測應(yīng)用。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot技術(shù)檢測50只小鼠皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段M3R變化情況。在顯微鏡x400倍下，于損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞率。應(yīng)用Scion image軟件檢測各時(shí)間段的平均光密度值，測得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。用SPSS13.0 for Windows進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

5、　 結(jié)果：
　　 正常對(duì)照組小鼠皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺及皮肌層中均表達(dá)M3R。皮膚切創(chuàng)傷后6h，可見少數(shù)多形核粒細(xì)胞有M3R表達(dá)；傷后12～24h，大量的多形核粒細(xì)胞和部分單個(gè)核細(xì)胞M3R呈陽性；傷后1～3d隨著時(shí)間的延長，M3R陽性細(xì)胞主要以單個(gè)核細(xì)胞為主；傷后5～14d，M3R主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞中。傷后0～6h，M3R陽性細(xì)胞率較低，隨著傷后時(shí)間的延長，M3R陽性細(xì)胞率逐漸增加，12h達(dá)到高峰，傷后1～5d一直呈高表達(dá)

6、狀態(tài)，傷后7d M3R陽性細(xì)胞率再次達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。各時(shí)間組與相鄰上組的細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示正常對(duì)照皮膚有M3R陽性條帶，皮膚切創(chuàng)傷后各時(shí)間段組M3R表達(dá)強(qiáng)度有一定規(guī)律。傷后0～12h，陽性條帶逐漸增強(qiáng)，1d，稍有下降，3d、5d，條帶變化不明顯，7d，M3R.陽性條帶再次達(dá)到高峰，傷后10d，M3R減弱，到傷后14d，M3R陽性條帶基本與正常對(duì)照組條帶情況一致