小檗堿通過α7煙堿樣膽堿能受體相關(guān)的膽堿能抗炎通路改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的分子機(jī)制.pdf

1、第一部分大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組腺病毒制作
　　目的：
　　構(gòu)建大鼠煙堿樣乙酰膽堿受體α7亞型（α7nAchR）基因短發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達(dá)載體，并篩選制作出具有α7nAchR基因表達(dá)干擾效果的重組腺病毒。
　　方法：
　　在Genebank中查找大鼠α7nAchR基因全序列，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成編碼α7nAchR基因 shRNA的DNA模板引物AY3

2、18、AY587、AY4444+559、AY318+857，分別與線性化的質(zhì)粒載體pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2，pGenesil-1.3連接，以分別構(gòu)建編碼1條α7nAchR基因 shRNA和編碼2條α7nAchR基因 shRNA的重組質(zhì)粒載體；重組質(zhì)粒載體感染感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，并用含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；提取細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行特定酶切，并用1％的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖的DNA片

3、段大小鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；用LR體外同源重組法將AY318，AY444+559，AY857shRNA表達(dá)框分別從重組質(zhì)粒pGenesil轉(zhuǎn)移至腺病毒pGSadeno質(zhì)粒表達(dá)載體上，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒；用相同的方法感染DH5a細(xì)胞，并用XbaI進(jìn)行單酶切，收集酶切產(chǎn)物，并用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖鑒定重組腺病毒 pGSadeno質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；提取線性化的重組腺病毒DNA并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)放大培養(yǎng)獲得所需滴度的重

4、組腺病毒上清；將重組腺病毒感染GH3細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、重組腺病毒HK對(duì)照組、重組腺病毒AY318 shRNA組、重組腺病毒AY857 shRNA組、重組腺病毒AY444+559 shRNA組，提取RNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)α7nAchR基因的表達(dá)情況，選擇具有最佳基因干擾效果的重組腺病毒。
　　結(jié)果：
　　限制性內(nèi)切酶SacI酶切重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-AY318、pGenesil-1.4-AY857，分別出現(xiàn)

5、2條約1000bp和700bp的DNA片段，說明重組質(zhì)粒編碼成功；限制性內(nèi)切酶 HindIII和 EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒載體 pGenesil-1.3-AY318+857和pGenesil-1.2-AY444+559，出現(xiàn)一條約700bp的DNA條帶，表明重組質(zhì)粒編碼成功；XbaI單酶切重組腺病毒質(zhì)粒載體pGSadeno–AY444+559，AY318，AY857 shRNA，出現(xiàn)一條約2.5Kb的DNA條帶，說明重組腺病毒成功；重組

6、腺病毒感染GH3細(xì)胞，熒光顯微鏡下有綠色熒光蛋白表達(dá)，說明重組腺病毒具有感染力；重組腺病毒感染GH3細(xì)胞，與正常對(duì)照組比較，α7nAchR基因表達(dá)在重組腺病毒HK對(duì)照組無明顯變化，而在重組腺病毒AY318 shRNA組、重組腺病毒AY857 shRNA組、重組腺病毒AY444+559 shRNA組均顯著下降，其中以重組腺病毒AY857 shRNA組下降最明顯。
　　結(jié)論：
　　具有感染力和干擾α7nAchR基因表達(dá)的重組腺病

7、毒質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，且pGSadeno–AY857 shRNA具有最強(qiáng)的基因干擾效果。
　　第二部分小檗堿通過α7nAchR膽堿能抗炎通路改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的分子機(jī)制
　　目的：
　　探討小檗堿是否通過α7nAchR膽堿能抗炎通路（CAP）發(fā)揮改善2型糖尿?。═2DM）大鼠胰島素抵抗的作用。
　　方法：
　　Wistar雄性大鼠SPF級(jí)飼養(yǎng)，采用高糖高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素（STZ）尾靜脈注射建

8、立大鼠 T2DM模型，動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、小檗堿組、煙堿組、二甲雙胍組、另設(shè)正常對(duì)照組；同一批次另一部分 T2DM大鼠通過尾靜脈注射小劑量α7nAchR基因干擾重組腺病毒，建立α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠模型，并隨機(jī)分為 T2DM+空白腺病毒組、T2DM+重組腺病毒組、T2DM+重組腺病毒+小檗堿組，另設(shè)T2DM對(duì)照組、正常對(duì)照組。用相應(yīng)的干預(yù)措施治療6周后，處死動(dòng)物。氧化酶法檢測(cè)各組血清總膽堿酯酶（TCHE）活性，乙酰膽堿（A

9、ch）水平，空腹血糖（FPG）水平；ELISA法測(cè)血清空腹胰島素（FINS），腫瘤壞死因子α（TNF-α），白介素1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）；免疫組化法檢測(cè)肝組織α7nAchR蛋白的表達(dá)，并分析陽性區(qū)域的平均光密度值（MOD）；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）檢測(cè)肝組織的核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB p65），磷酸肌醇-3激酶（PI-3K），胰島素受體底物1（IRS-1），絲氨酸307位磷酸化胰島素受體底物1（I

10、RS-1 ser307），葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2（Glut2），脂肪組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（Glut4）蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR法（RT-PCR）檢測(cè)肝組織和骨骼肌組織的α7nAchR、胰島素受體（IR）、IRS-1的mRNA及骨骼肌組織的Glut4 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　與正常組比較，模型組大鼠體重顯著降低，F(xiàn)PG、FINS、HOMA-IR明顯升高（P<0.01）；血清TCHE活性明顯升高，Ach水平明顯下降（P<0.0

11、1）；血清IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01），而IL-6水平無明顯變化；肝組織NF-κB p65和α7nAchR蛋白表達(dá)顯著升高，pIRS-1 ser307與 IRS-1的比值（pIRS-1 ser307/ IRS-1）升高，而肝組織PI-3K p85、GLUT2蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01），脂肪組織GLUT4蛋白下降（P<0.05）；肝組織和骨骼肌組織IR、IRS-1 mRNA和骨骼肌組織GLUT4 mRNA的表

12、達(dá)均顯著下降（P<0.01），骨骼肌組織α7nAchR mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。與模型組比較，小檗堿組大鼠體重?zé)o明顯變化，F(xiàn)PG、FINS、HOMA-IR均顯著下降（P<0.01）；血清TCHE活性下降，而Ach水平升高（P<0.05，P<0.01）；血清IL-1β水平下降（P<0.01），而IL-6水平無明顯變化；肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)減少，pIRS-1 ser307/ IRS-1比值下降（P<0.05，P<0.

13、01）；肝組織PI-3K p85、GLUT2和α7nAchR蛋白表達(dá)增加，脂肪組織GLUT4蛋白表達(dá)增加（P<0.01）；肝組織中IR、IRS-1和α7nAchR mRNA，骨骼肌組織IRS-1、α7nAchR和GLUT4 mRNA的表達(dá)均有不同程度升高（P<0.05，P<0.01）。
　　在重組腺病毒α7nAchR基因沉默的大鼠中，與正常組比較，其余各組大鼠體重顯著下降，F(xiàn)PG、FINS、HOMA-IR均顯著上升（P<0.05，

14、P<0.01）；各組血清中的TCHE活性不同程度升高，Ach水平下降（P<0.05，P<0.01），而T2DM+重組腺病毒+小檗堿組無明顯差異；血清 IL-1β、TNF-α水平均升高（P<0.05，P<0.01），而IL-6無明顯變化；肝組織NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，pIRS-1 ser307/IRS-1比值升高，PI-3K p85、GLUT2蛋白表達(dá)下降，脂肪組織GLUT4蛋白表達(dá)下降（P<0.05，P<0.01）；肝組織和骨骼

15、肌組織IR、IRS-1 mRNA、骨骼肌組織GLUT4 mRNA表達(dá)均顯著下降（P<0.05，P<0.01）；肝組織α7nAchR蛋白在T2DM對(duì)照組和T2DM+空白腺病毒組顯著上調(diào)（P<0.01），而在T2DM+重組腺病毒組和T2DM+重組腺病毒組+小檗堿組下調(diào)（P<0.05）；肝組織和骨骼肌組織α7nAchR mRNA在T2DM對(duì)照組與T2DM+空白腺病毒組表達(dá)上調(diào)（P<0.05，P<0.01）。與T2DM組和T2DM+空白腺病毒組

16、比，T2DM+重組腺病毒組和T2DM+重組腺病毒+小檗堿組肝組織α7nAchR mRNA和蛋白表達(dá)水平下降（P<0.05，P<0.01），骨骼肌組織α7nAchR mRNA表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）；T2DM+重組腺病毒+小檗堿組TCHE活性下降（P<0.05）、Ach水平升高（P<0.01），余各指標(biāo)無顯著差異。與 T2DM+重組腺病毒組比，T2DM+重組腺病毒+小檗堿組TCHE活性顯著下降，Ach水平顯著上升（P<0.05），

17、余各指標(biāo)無顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.實(shí)驗(yàn)成功建立了T2DM胰島素抵抗大鼠模型和α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠模型。
　　2.小檗堿可以抑制T2DM和α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠膽堿酯酶活性，增加Ach濃度；小檗堿可以降低T2DM大鼠血清炎癥因子水平，促進(jìn)α7nAchR蛋白和mRNA的表達(dá)，并下調(diào)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65蛋白表達(dá)，而α7nAchR基因沉默后不能下調(diào)NF-κB p65蛋白和血

18、清炎癥因子，說明小檗堿可能通過α7nAchR相關(guān)的CAP（Ach-α7nAchR-JAK/STAT-NF-κB）改善T2DM大鼠炎癥反應(yīng)。
　　3.小檗堿能夠改善T2DM大鼠胰島素傳遞信號(hào)通路IR/IRS-1-PI3K/AKT-GLUT相關(guān)因子的蛋白和mRNA表達(dá)，促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善胰島素抵抗，而在α7nAchR基因沉默的T2DM大鼠中卻不能改善胰島素抵抗，說明α7nAchR與胰島素抵抗密切相關(guān)。
　　4.小檗堿激活T