nACnRa7在小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過(guò)程中表達(dá)的研究.pdf

1、目的:皮膚損傷愈合是一個(gè)典型的炎癥修復(fù)過(guò)程?？扇藶榈胤殖扇齻€(gè)階段:炎癥階段、增殖階段、再塑階段。這些階段在一定程度上相互重疊,沒(méi)有明確的時(shí)間界限。炎癥細(xì)胞的募集、成纖維細(xì)胞的激活、血管發(fā)生及肉芽組織的形成構(gòu)成一系列錯(cuò)綜復(fù)雜且相互交流的事件。最近研究顯示,血液中的纖維細(xì)胞(circulatingfibrocytes,CFCs)也可以浸潤(rùn)到傷口局部,通過(guò)分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,Myfbs),參與到皮膚損傷愈合的進(jìn)程

2、。
　　 CFCs是骨髓來(lái)源的間充質(zhì)前體細(xì)胞,共表達(dá)造血干細(xì)胞抗原和成纖維細(xì)胞產(chǎn)物,諸如CD45和前膠原Ⅰ(procollagenⅠ),被定義為一類具有成纖維細(xì)胞特性的特殊白細(xì)胞亞群。在皮膚損傷愈合期間,CFCs占浸潤(rùn)細(xì)胞的10％左右。CFCs已經(jīng)被推測(cè)在損傷愈合和組織修復(fù)進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。除了分化為Myfbs外,CFCs還可以通過(guò)其他可能的機(jī)制參與到損傷愈合,諸如:抗原呈遞;產(chǎn)生重要的細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子;分泌

3、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM);促進(jìn)血管發(fā)生。
　　 膽堿系統(tǒng)由煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChR)和毒蕈堿型乙酰膽堿受體(muscarinic acetylcholine receptors,mAChR),乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)及合成、降解Ach的酶組成。該系統(tǒng)對(duì)于神經(jīng)信號(hào)的傳遞起到重要的調(diào)節(jié)作用。然而,研究表

4、明,膽堿系統(tǒng)也被表達(dá)于不同種類的非神經(jīng)元性組織或細(xì)胞。諸如:角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及外周的白細(xì)胞可以自身合成Ach,并表達(dá)不同的nAChR和mAChR。這已經(jīng)被提出,Ach不僅是一種特異的神經(jīng)遞質(zhì),也是一種普遍的細(xì)胞遞質(zhì)。最近的研究顯示了煙堿型乙酰膽堿受體alpha7亞單位(nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit,nAChRα7)可以被不同類型的非神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá),在調(diào)節(jié)炎癥、血管發(fā)

5、生及角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用,并密切牽涉到成纖維細(xì)胞中膠原的表達(dá)。
　　 然而,nAChRα7在皮膚損傷愈合進(jìn)程中表達(dá)和分布的特征,目前尚不清楚。本研究旨在探討:(1)nAChRβ7在皮膚損傷愈合過(guò)程中表達(dá)和分布的特征;(2)浸潤(rùn)的CFCs和其分化成的Myfbs在皮膚損傷愈合中的分布特征;(3)nAChRα7是否表達(dá)于浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CFCs和其轉(zhuǎn)化成的Myfbs。
　　 材料與方法:

6、　　 1、切創(chuàng)動(dòng)物模型的建立健康成年雄性BALB/c小鼠45只,體質(zhì)量30～35g,隨機(jī)分為9組。其中皮膚切創(chuàng)分為8個(gè)時(shí)間段組,另一組為正常對(duì)照組,每組均為5只小鼠。腹腔注射戊巴比妥鈉,背部剪毛處理后,常規(guī)手術(shù)消毒,在背部中央做一縱行長(zhǎng)1cm皮膚全層切口,深達(dá)筋膜。傷后每只單獨(dú)飼養(yǎng),避免細(xì)菌感染。分別于傷后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d和14d將小鼠脫頸椎處死,取傷口處1.5cm×2.0cm皮膚組織,正常對(duì)照組小鼠麻醉后

7、背部剪毛,不做切創(chuàng),觀察至14d,脫頸椎處死,取相同部位同等大小皮膚。各組5只小鼠的皮膚樣本被均分為兩部分,一部分用于石蠟切片的HE染色、免疫組織化學(xué)染色,另一部分用于Western blot和RT-PCR評(píng)價(jià)。
　　 2、組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色所取皮膚樣本經(jīng)4％多聚甲醛(pH7.4)固定12h,脫水、透明,包埋在石蠟中,制作5μm厚度連續(xù)切片,進(jìn)行HE染色及nAChRa7的免疫組化染色。顯微鏡×400倍視野下,進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞

8、計(jì)數(shù)。
　　 3、Western Blot檢測(cè)nAChRα7蛋白提取樣本總蛋白,上樣量為50ug。轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后用5％脫脂奶粉封閉,用兔抗小鼠nAChRα7多克隆抗體(1:1000)、小鼠抗小鼠GAPDH單克隆抗體(1:2000)4℃孵育過(guò)夜,分別用相應(yīng)的二抗37℃孵育,ECL發(fā)光1分鐘,膠片中的蛋白條帶經(jīng)Biolmaging systems采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定。目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量。<

9、br>　　 4、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)nAChRα7的mRNA用Trizol Reagent提取皮膚樣本的總RNA.用RNA PCR試劑盒擴(kuò)增目的片段。PER產(chǎn)物電泳后,用嗅化乙淀染色,BioImaging Systems系統(tǒng)成像,用NIH image軟件分析產(chǎn)物條帶灰度,目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量。
　　 5、免疫熒光染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,進(jìn)行CD45/procollagenⅠ、C

10、D45/α-SMA、F4/80/nAChRα7、CD45/procollagenⅠ/nnAChRα7、CD45/α-SMA/nAChRα7之間的雙重或三重免疫熒光的共定位。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、切創(chuàng)后形態(tài)學(xué)改變傷后6h見多核粒細(xì)胞(polymorphonuclear cells,PMNs)出現(xiàn)在

11、傷口的周圍,于傷后12h顯著增多。傷后1d圓形的單核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs)聚集于傷口的邊緣,于傷后3d達(dá)到峰值。傷后3d,成纖維細(xì)胞(fibroblastic cells,FBCs)也開始出現(xiàn)在傷口底部,于傷后5d顯著增多,傷后7d達(dá)到峰值。傷后5～10d,肉芽組織形成,其內(nèi)可見大量的新生血管和FBCs。傷后10d,表皮完全覆蓋創(chuàng)口。傷后14d,損傷區(qū)新生血管和FBCs數(shù)量顯著減少,間質(zhì)增多,肉芽組織向瘢痕

12、組織轉(zhuǎn)變。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色正常對(duì)照組小鼠皮膚nAChRα7分布于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及少量成纖維樣細(xì)胞。小鼠皮膚切創(chuàng)傷后6h～12h,可見少數(shù)PMNs和MNCs表達(dá)nAChRα7。傷后1d～3d,以MNCs表達(dá)為主。傷后5d～14d,nAChRα7主要表達(dá)于FBCs。此外,傷后5d～14d,再生血管的內(nèi)皮樣細(xì)胞和新生的表皮也顯示了nAChRα7的陽(yáng)性反應(yīng)。nAChRα7陽(yáng)性細(xì)胞率在傷后6h～12h較低,隨著傷

13、后時(shí)間的延長(zhǎng),nAChRα7陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸增加,于傷后7d達(dá)到高峰,隨后逐漸下降。
　　 3、Western blot和RT-PCR檢測(cè)nAChRα7蛋白和mRNA被觀察于小鼠正常皮膚和各切創(chuàng)組。皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段nAChRα7蛋白和mRNA變化規(guī)律基本一致。和正常組比較,傷后1d,蛋白和mRNA水平明顯增強(qiáng);傷后7d,達(dá)到高峰;10d～14d逐漸下降。
　　 4、雙重免疫熒光檢測(cè)CFCs及其分化成的Myfbs小鼠皮膚切

14、創(chuàng)后3d,CFCs(CD45+/procollagen I+ cells)開始出現(xiàn)于創(chuàng)口周圍;傷后5d,CD45陽(yáng)性的Myths(CD45+/α-SMA+ cells)開始出現(xiàn)于新生的肉芽組織。CFCs和CD45陽(yáng)性的Myfbs的數(shù)量于傷后7d達(dá)到峰值。
　　 5、雙重/三重免疫熒光鑒定表達(dá)nAChRα7的細(xì)胞型在小鼠皮膚切創(chuàng)愈合的過(guò)程中,nAChRα7時(shí)序性表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CFCs及其分化成的Myfbs。
　

15、　 結(jié)論:
　　 1、正常小鼠皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及少量成纖維樣細(xì)胞表達(dá)nAChRα7。
　　 2、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過(guò)程中,CFCs浸潤(rùn)和分化的規(guī)律可為皮膚損傷時(shí)間的推斷提供新的參考依據(jù)。
　　 3、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過(guò)程中,nAChRα7時(shí)序性表達(dá)在PMNs、巨噬細(xì)胞、CFCs、Myfbs、再生血管的內(nèi)皮樣細(xì)胞和新生的表皮,提示nAChRα7可能參與皮膚損傷愈合。
　　 4、小鼠皮膚切創(chuàng)愈