Lefty在創(chuàng)面修復(fù)和瘢痕形成過程中表達(dá)的研究.pdf

1、一、研究背景： 創(chuàng)面愈合過程中增生性瘢痕的形成是康復(fù)醫(yī)學(xué)、整形學(xué)、燒傷和創(chuàng)傷等領(lǐng)域亟待解決的醫(yī)學(xué)難題之一。而胚胎皮膚，尤其是早齡胚胎皮膚，傷口愈合迅速且無瘢痕形成，稱為胚胎無瘢痕愈合。目前，研究顯示眾多的細(xì)胞因子及其受體參與了創(chuàng)面修復(fù)，形成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，共同影響創(chuàng)面愈合的結(jié)局，但具體的機(jī)制仍不清楚。 在眾多的細(xì)胞因子中，以轉(zhuǎn)化生長因子β(Tansforming Growth Factor beta，TGF-p

2、)的研究最為深入。研究顯示TGF-β，一方面促進(jìn)膠原的合成，另一方面抑制膠原的降解，在瘢痕形成和胚胎無瘢痕愈合中具有重要的作用。因此，TGF-β被認(rèn)為是影響創(chuàng)面愈合的重要介導(dǎo)因子之一。 有文獻(xiàn)表明：Lefty，一種新型的TGF-β阻斷劑，能抑制TGF-β的功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響成纖維細(xì)胞的增殖分化，抑制膠原的合成，促進(jìn)膠原的降解。根據(jù)上述研究，我們推測Lefty可能對瘢痕形成有抑制作用并與胎兒的無瘢痕愈合相關(guān)，但其在成人正常皮膚、

3、人胚胎皮膚、增生性瘢痕組織、創(chuàng)面愈合過程中的表達(dá)尚未見報道。 二、目的： 為進(jìn)一步了解Lefty在瘢痕形成中的作用，并明確其是否與胚胎無瘢痕愈合相關(guān)，我們對動物模型進(jìn)行了改良，并采用免疫熒光染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)等技術(shù)手段，從蛋白水平和mRNA水平對Lefty在成人正常皮膚、人胚胎皮膚、人增生性瘢痕組織、動物

4、模型中創(chuàng)面瘢痕愈合和胚胎無瘢痕愈合過程中的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察。 三、方法： 將30只裸鼠隨機(jī)分成3組，每組10只。第一組為瘢痕動物模型改良組。將傳統(tǒng)瘢痕動物模型中人全厚皮片移植的位置改在裸鼠背部的皮下；移植物存活后，用加熱的銅柱對其進(jìn)行深I(lǐng)I度燒傷；觀察創(chuàng)面愈合過程中的瘢痕增生情況。第二組為人胚胎無瘢痕動物模型組。將人胚胎皮膚移植于裸鼠背部皮下；移植物存活后，用加熱的銅柱對其進(jìn)行深I(lǐng)I度燒傷：觀察創(chuàng)面愈合情況。第三組為類

5、似瘢痕增生(Analog ofHypertrophic Scar， AHS)動物模型組。在裸鼠背部直接移植人全厚皮片后，不予任何處理，觀察皮片干痂脫落后創(chuàng)面愈合情況。 對瘢痕動物模型改良組和人胚胎無瘢痕動物模型組燒傷前，燒傷后第1、2、3、7、14天，第1、3、6個月的移植物，類似瘢痕增生動物模型組移植后第3個月的移植物進(jìn)行取材，同時留取成人正常皮膚(10例)、人胚胎皮膚(8例)、人增生性瘢痕組織(15例)標(biāo)本。通過形態(tài)學(xué)和組織

6、學(xué)觀察，免疫熒光染色及RT-PCR等技術(shù)，觀察各組動物模型中移植物的變化；成人正常皮膚、胚胎皮膚、人增生性瘢痕組織及各模型組標(biāo)本的組織學(xué)表現(xiàn)，Lefty蛋白的表達(dá)部位；以各標(biāo)本中陽性細(xì)胞所占比率及圖像分析儀所測得各標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物與內(nèi)參灰度值的比值做為表達(dá)量，對Lefty的表達(dá)進(jìn)行半定量測定，結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 四、結(jié)果： 1、動物模型的建立 瘢痕動物模型改良組中10只裸鼠存活9只；移

7、植存活皮片與成人正常皮膚相比，無明顯差異；移植物燒傷后1個月后，有8只可見明顯瘢痕增生，與人增生性瘢痕組織相比，無明顯差異；瘢痕增生于燒傷后第2個月達(dá)到高峰，6個月后大部分瘢痕仍高于皮面。人胚胎皮膚無瘢痕動物模型組中10只裸鼠均存活；移植存活皮片與人胚胎皮膚相比，無明顯差異；移植物燒傷后6個月內(nèi)未見明顯瘢痕增生。類似瘢痕增生動物模型組中10只裸鼠存活8只；移植皮片干痂脫落后，有6只在移植區(qū)域出現(xiàn)類似瘢痕樣增生，其組織學(xué)表現(xiàn)與人增生性瘢痕

8、組織相比，無明顯差異；類似的瘢痕增生于移植后第4個月增生達(dá)到高峰，8個月后大部分瘢痕仍高于皮面。 2、成人正常皮膚、人胚胎皮膚、人增生性瘢痕組織中Lefty表達(dá)的觀察 免疫熒光染色結(jié)果：Lefty蛋白的陽性表達(dá)分布在成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中，分布不均勻。成人正常皮膚、人胚胎皮膚、人增生性瘢痕組織中Lefty蛋白陽性細(xì)胞率分別為15.38％、67.92％、84.48％，經(jīng)X2檢驗，人增生性瘢痕組織中Lefty的表達(dá)低于人正常皮膚

9、與人胚胎皮膚(p<0.01)；人胚胎皮膚中Lefty的表達(dá)高于成人正常皮膚(p<0.05)。 RT-PCR結(jié)果：Lefty在成人正常皮膚、人胚胎皮膚、人增生性瘢痕組織中均有陽性表達(dá)。三組標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物與內(nèi)參的灰度值之比分別為：0.4961±0.0473、1.2037±0.1261、1.6013±0.1283。經(jīng)單因素方差分析，人增生性瘢痕組織中Lefty的表達(dá)低于人正常皮膚與人胚胎皮膚(p<0.05)；人胚胎皮膚中Lef

10、ty的表達(dá)高于成人正常皮膚(p<0.05)。 3、動物模型創(chuàng)面修復(fù)過程中Lefty表達(dá)的觀察 免疫熒光染色結(jié)果：Lefty蛋白的陽性表達(dá)分布在成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中，分布不均勻。瘢痕動物模型改良組中，燒傷前，燒傷后第1、2、3、7、14天，第1、3、6個月的組織中Lefty陽性細(xì)胞率分別為：66.67％、67.92％、70.91％、66，04％、60.78％、51.02％、42.22％、19.05％、17.07％，經(jīng)χ2檢驗

11、，p<0.05，提示各組數(shù)據(jù)間存在統(tǒng)計學(xué)差異。Lefty在燒傷前至燒傷后14天各組標(biāo)本中的表達(dá)與成人正常皮膚中的表達(dá)相比，無明顯差異(p>0.05)；燒傷1個月后的表達(dá)出現(xiàn)下降(p<0.05)；之后維持在低水平表達(dá)(p<0.05)。燒傷3個月后的表達(dá)接近人瘢痕組織中的表達(dá)(p>0.05)。人胚胎無瘢痕動物模型組中，燒傷前，燒傷后第1、2、3、7、14天，第1、3、6個月的組織中Lefty陽性細(xì)胞率分別為：79.37％、80.65％、82

12、.54％、79.69％、80.33％、79.66％、78.95％、78.69％、76.67％，經(jīng)X2檢驗，p>0.05，提示各組數(shù)據(jù)間無統(tǒng)計學(xué)差異。與人胚胎皮膚相比，各組數(shù)據(jù)均無明顯差異(p>0.05)，顯示Lefty在無瘢痕愈合過程中無明顯變化，維持了較高水平表達(dá)。 RT-PCR結(jié)果：Lefty在兩種動物模型的創(chuàng)面修復(fù)過程中均有陽性表達(dá)。瘢痕動物模型改良組中，燒傷前，燒傷后第1、2、3、7、14天，第1、3、6個月的各組標(biāo)本

13、RT-PCR產(chǎn)物與內(nèi)參的灰度值之比分別為：1.0316±0.0680、1，0510±0.0838、1.0960±0.0764、1.0237±0.1070、0.9410±0.0660、0.7907±0.0807、0.6553±0.0465、0.2949±0，0351、0.2652±0.0511，經(jīng)單因素方差分析，p<0.05，提示Lefty在瘢痕修復(fù)過程中，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Lefty在燒傷前至燒傷后3天各組標(biāo)本中的表達(dá)與成人正

14、常皮膚中的表達(dá)相比，無明顯差異(p>0.05)；燒傷后7天移植組織中出現(xiàn)下降(p<0.05)；之后維持在低水平表達(dá)(p<0.05)。燒傷后3個月移植組織中表達(dá)接近人瘢痕組織中的表達(dá)(p>0.05)。人胚胎無瘢痕動物模型組中，燒傷前，燒傷后第1、2、3、7、14天，第1、3、6個月的各組標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物與內(nèi)參的灰度值之比分別為：1.1058±0.0539、1.1234±0.0545、1.1504±0.0633，1.1095±0.047

15、4、1.1199±0.0775、1.1097±0.0494、1.1020±0.0962、1.0971±0.0678、1.0696±0.0792，經(jīng)單因素方差分析，p>0.05，提示各組數(shù)據(jù)間無統(tǒng)計學(xué)差異。與人胚胎皮膚相比，各組數(shù)據(jù)均無明顯差異(p>0.05)，顯示Lefty在無瘢痕愈合過程中無明顯變化，維持了較高水平表達(dá)。 五、結(jié)論： 1、改良后的瘢痕動物模型移植存活組織與成人正常皮膚無明顯差異，動物與皮片的存活率、瘢痕

16、復(fù)制率提高，建立周期縮短，瘢痕增生明顯，可用于觀察創(chuàng)面愈合至瘢痕形成的全過程，是一種較理想的動物模型。 2、Lefty在人增生性瘢痕組織中的表達(dá)低于成人正常皮膚與人胚胎皮膚；在人胚胎皮膚中的表達(dá)高于成人正常皮膚。該結(jié)果提示Lefty的低表達(dá)可能是瘢痕形成的原因之一，而其高表達(dá)可能與胚胎無瘢痕愈合密切相關(guān)。 3、瘢痕動物模型改良組中，成人正常皮膚燒傷后形成明顯的，持續(xù)的增生。Lefty表達(dá)在燒傷后7天mRNA水平降低，燒傷