小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中周圍型大麻素受體的時(shí)間依賴性表達(dá)研究.pdf

1、皮膚損傷愈合是典型的組織損傷修復(fù)的過程,其大致可以分為三個(gè)階段:炎癥期、細(xì)胞的活化增殖遷移期和重建修復(fù)期,其各階段是相互聯(lián)系,相互影響的。皮膚的損傷愈合過程連續(xù)而復(fù)雜,是一個(gè)在時(shí)間和空間上受一定的細(xì)胞生物因子所調(diào)控的生物學(xué)過程,有大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的參與其間,多種炎性細(xì)胞的激活呈一定的時(shí)間規(guī)律性,首先中性粒細(xì)胞開始募集,然后巨噬細(xì)胞聚集,最后成纖維細(xì)胞和血液中的纖維細(xì)胞(circulating fibrocytes,CFCs)轉(zhuǎn)化為

2、肌成纖維細(xì)胞。
　　 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)主要由大麻素受體(cannabinoid receptor,CBR)、內(nèi)源性大麻素(endocannabinoid)和合成與降解內(nèi)源性大麻素的酶組成。CBR分為1型大麻素受體(type1 cannabinoid receptor,CB1R)和2型大麻素受體(type2eannabinoid receptor,CB2R)兩個(gè)亞型。基因克隆研究發(fā)現(xiàn)CB2R與CB1R的主要區(qū)別在于其氨基酸序列、信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、器官分布及對某些激動(dòng)劑和抑制劑敏感度的不同。CB2R同樣可以激活多重細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括通過抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制鈣通道、激活鉀通道、激活MAP激酶通道抑制cAMP的生成。皮膚損傷愈合過程中,巨噬細(xì)胞發(fā)揮了關(guān)鍵作用,同時(shí)CB2R在巨噬細(xì)胞中也表達(dá),因此,我們可以推測,參與皮膚損傷愈合過程中的單核細(xì)胞亦可能表達(dá)CB2R,并可能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用。大麻素受體CB2還在肝纖維化的星形細(xì)胞和肝肌成纖維細(xì)胞中表達(dá),通過抑制增殖和

4、促進(jìn)凋亡,發(fā)揮了重要的抗纖維化的作用。
　　 目的：
　　 本研究旨在探討:①CB2R在皮膚損傷愈合過程中時(shí)間依賴性的蛋白表達(dá)和分布的特征;②CB2R在巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。③死后不同時(shí)間對檢測生前皮膚損傷后CB2R表達(dá)的影響。期望通過這些研究,為進(jìn)一步研究CB2R在皮膚損傷愈合過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ),并探討CB2R在法醫(yī)實(shí)踐中用于推斷損傷時(shí)間的司能性。
　　 材料與方法：
　　 一、動(dòng)物模

5、型建立與分組
　　 健康成年雄性BALB/c小鼠70只,體質(zhì)量30～35g,隨機(jī)分為14組。其中皮膚切創(chuàng)分為13個(gè)時(shí)間段組,另一組為正常對照組,每組均為5只小鼠。腹腔注射戊巴比妥鈉,背部剪毛處理后,常規(guī)手術(shù)消毒,在背部中央做一縱行1.5cm長皮膚全層切口,深達(dá)筋膜。傷后每只小鼠單獨(dú)飼養(yǎng),避免細(xì)菌感染。分別于傷后0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d、17d、21d將小鼠脫頸椎處死,取創(chuàng)口處1.

6、5cm×1.0cm皮膚組織,正常對照組小鼠麻醉后背部剪毛,不做切創(chuàng),觀察至21d,脫頸椎處死,取相同部位同等大小皮膚。各組5只小鼠的皮膚樣本被均分為兩部分,一部分用于石蠟切片的HE染色、免疫組織化學(xué)和雙重免疫熒光染色,另一部分用于Western blot和Real-Time RT-PCR檢測。
　　 為觀察不同死后間隔時(shí)間對CB2R檢測的影響,另取健康成年雄性BALB/c小鼠40只,體質(zhì)量30～35g,隨機(jī)分為8組,每組均為5只

7、小鼠。在生前傷5d后脫頸椎處死,置22℃室溫,濕度70％,以死后放置時(shí)間不同,分別于死后0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d提取皮膚樣本進(jìn)行Western blot和Real-Time RT-PCR檢測。
　　 二、HE及免疫組織化學(xué)染色
　　 所取皮膚樣本在4％多聚甲醛(pH7.4)中固定12h,經(jīng)脫水、透明,石蠟包埋,制作5μm厚度連續(xù)切片,進(jìn)行HE染色及CB2R的免疫組織化學(xué)染色。
　　 三

8、、免疫熒光染色
　　 石蠟切片分別進(jìn)行CB2R和F4/80、CB2R和α-SMA的雙重免疫熒光染色。
　　 四、CB2R和GAPDH蛋白檢測
　　 提取樣本總蛋白,上樣量為50μg。轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后用5％脫脂奶粉封閉,用兔抗小鼠CB2R多克隆抗體(1:400)、小鼠抗小鼠GAPDH單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜,分別用相應(yīng)的二抗室溫孵育,ECL發(fā)光,蛋白條帶經(jīng)電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)(MF-ChemiBI

9、S3.2,DNR Bio-Imaging Systems,ISR)掃描,用Scion Image軟件(Scion Corporation,Maryland,USA)檢測CB2R灰度值與GAPDH灰度值,兩者比值為其相對蛋白定量。
　　 五、Real-Time PCR檢測CB2R和β-actin mRNA
　　 (一)RNA提取
　　 以Trizol法提取細(xì)胞總RNA。紫外可見光分光光度計(jì)(Nano Photome

10、ter,IMPLEN,Germany)測定OD260/OD280值和RNA濃度,并將樣品部分RNA稀釋成0.5μg/μl。
　　 (二)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
　　 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。
　　 ()反應(yīng)條件:37℃,15min;85℃,5sec
　　 (二)Real-time RT-PCR反應(yīng)
　　 (三)Real-time RT-PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)特異性引物見表2,Real-time RT-PCR反應(yīng)體系見表

11、3。表2,引物序列和產(chǎn)物長度
　　 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 用SPSS13.0 for Windows對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、皮膚切創(chuàng)愈合過程中形態(tài)學(xué)所見
　　 小鼠皮膚切創(chuàng)后創(chuàng)口哆開伴明顯出血及滲液。傷后6h,創(chuàng)口稍干燥。傷后12h,可見創(chuàng)口已少量結(jié)痂。傷后1d,創(chuàng)口已無滲血、滲液,創(chuàng)口皮膚干燥,可見完整痂皮。傷后3d,創(chuàng)緣皮膚收縮

12、、平整,紅腫消退。傷后5～7d,痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離,部分已剝離,創(chuàng)口表面被增生的上皮覆蓋,可見皮下紅色肉芽組織。傷后10d,創(chuàng)口已呈線形愈合,無滲出,并明顯短縮。傷后14d,創(chuàng)口已完全愈合,僅留線狀瘢痕,部分小鼠創(chuàng)口皮膚稍隆起,質(zhì)地較韌。
　　 二、皮膚切創(chuàng)后不同死后間隔時(shí)間內(nèi)形態(tài)學(xué)所見
　　 傷后5d的皮膚切創(chuàng),死后即刻見痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離,部分已剝離。死后6h～12h創(chuàng)壁變化較小,較濕潤,皮膚及皮下組織未見腐敗。死后

13、24～48h皮膚變薄,創(chuàng)壁略變干,尸體腐敗,尸臭、尸綠出現(xiàn);取材時(shí)見肌肉部分混濁、變軟。死后3d,尸體腐敗顯著,取材時(shí)見肌肉混濁、變軟。
　　 三、皮膚切創(chuàng)愈合過程中病理組織學(xué)所見
　　 在對照組小鼠真皮內(nèi)可見少量靜止的成纖維細(xì)胞(fibroblastic cells,FBCs)。傷后0.5 h,傷口周圍真皮內(nèi)可見間質(zhì)疏松,但未見炎細(xì)胞的浸潤。傷后1h多形核細(xì)胞(polymorphonuclear cells,PMNs)

14、出現(xiàn)在傷口部位血管的周圍,PMNs于傷后3～6 h顯著增多,傷后12h達(dá)到浸潤高峰。傷后1d和3d,大量圓形的單核細(xì)胞(mononuclcar cells,MNCs)聚集于傷口的邊緣。傷后3d,FBCs也開始出現(xiàn)在傷口底部,于傷后5d顯著增多,傷后7d達(dá)到峰值。傷后5～10d,肉芽組織形成,其內(nèi)可見大量的毛細(xì)血管和FBCs。此外,傷后7d,新生表皮已完全覆蓋創(chuàng)口。傷后10d,新生血管和FBCs數(shù)量開始減少。傷后14～21d,肉芽組織逐漸

15、轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織。
　　 四、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 對照組小鼠皮膚CB2R分布于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及真皮中FBCs。皮膚切創(chuàng)傷后1～12h,可見少數(shù)PMNs有CB2R表達(dá)。隨著損傷時(shí)間的延長,陽性多核粒細(xì)胞被陽性MNCs和FBCs取代。傷后1d,大量MNCs呈CB2R陽性。傷后3d,呈CB2R陽性的FBCs開始出現(xiàn)于創(chuàng)口周圍。傷后5～14d,CB2R主要于表達(dá)在FBCs中。傷后17～21d仍然可見一些陽性的成纖

16、維細(xì)胞呈CB2R陽性。另外,在損傷愈合期間,新生血管平滑細(xì)胞也顯著表達(dá)CB2R。
　　 五、雙重免疫熒光染色結(jié)果
　　 對照組小鼠皮膚可見少許CB2R和F4/80雙陽性細(xì)胞;傷后1d和3d,大量CB2R陽性的巨噬細(xì)胞募集于傷口局部。隨著損傷時(shí)間的延長,CB2R陽性的巨噬細(xì)胞逐漸減少。傷后0.5h到傷后3d,未見α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞分布。傷后5d呈CB2R陽性的肌成纖維細(xì)胞出現(xiàn)于損傷區(qū);傷后7d達(dá)到峰值。隨著損傷時(shí)

17、間的延長,呈CB2R陽性的肌成纖維細(xì)胞逐漸減少;傷后21d,未見CB2R陽性的肌成纖維細(xì)胞。
　　 六、Western blot結(jié)果
　　 對照組小鼠皮膚有CB2R陽性條帶。皮膚切創(chuàng)傷各組CB2R蛋白表達(dá)強(qiáng)度有一定時(shí)間規(guī)律性。傷后5d,達(dá)到高峰:傷后7d,開始下降;到傷后21d,CB2R陽性條帶基本一致于正常對照組的表達(dá)水平。
　　 CB2R在死后各時(shí)間組均有陽性條帶,CB2R大約位于34kD處,死后各時(shí)間組CB

18、2R蛋白表達(dá)相對水平有一定時(shí)間規(guī)律。與死后0h組比較,死后6h組CB2R.蛋白表達(dá)相對水平開始顯著降低;至死后3d,CB2R蛋白表達(dá)相對水平降至最低值。
　　 七、Real-time RT-PCR結(jié)果
　　 損傷組皮膚組織中CB2R mRNA自0.5h即開始表達(dá)升高,傷后5d到達(dá)峰值,是正常對照組的4.47倍,隨后CB2R表達(dá)逐漸減弱,至傷后21d基本一致于正常對照組的表達(dá)水平。
　　 小鼠切創(chuàng)5d后不同死后間隔

19、時(shí)間CB2R mRNA在皮膚組織中的表達(dá)隨時(shí)間變化。死后0.5h、1h、3h的皮膚組織中與相應(yīng)生前損傷組CB2R mRNA無顯著性差異。和對照組比較,死后6h組CB2R mRNA表達(dá)相對水平開始降低;至死后3d,CB2R mRNA表達(dá)相對水平降至最低值。
　　 結(jié)論：
　　 1、正常小鼠皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)纖維外膜及神經(jīng)纖維束束膜呈CB2R的陽性分布。
　　 2、小鼠皮膚切創(chuàng)愈合