構(gòu)建臨床相關(guān)的寡灶-多灶型轉(zhuǎn)移模型及miRNA-200c的高表達(dá)對(duì)寡灶轉(zhuǎn)移細(xì)胞株體外特性影響研究.pdf

1、背景：腫瘤轉(zhuǎn)移是造成死亡的重要原因。但在我們?cè)缙谂R床和基礎(chǔ)研究展示了轉(zhuǎn)移灶數(shù)目有限（轉(zhuǎn)移病灶數(shù)<5或全身受累器官數(shù)<5）、穩(wěn)定或進(jìn)展緩慢的寡灶型轉(zhuǎn)移是一個(gè)有異于進(jìn)展迅速的多灶型轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移病灶數(shù)>5或全身受累器官數(shù)>5）的臨床診斷和治療的新實(shí)體。25％的寡灶型病人在接受寡灶型轉(zhuǎn)移針對(duì)性治療后能達(dá)治愈，而從寡灶向多灶型轉(zhuǎn)移的演變是治療失敗的根本原因。我們最近的臨床觀察顯示了 miR-200c的差異表達(dá)能夠分辯呈現(xiàn)穩(wěn)定寡灶型轉(zhuǎn)移和由寡灶向多灶

2、轉(zhuǎn)移演進(jìn)的病人，預(yù)示miR-200c有可能是調(diào)控寡灶向多灶型轉(zhuǎn)移演進(jìn)的重要機(jī)制之一。因此本課題欲從分子、細(xì)胞和腫瘤的不同層面，來(lái)闡明 miR-200C對(duì)促進(jìn)腫瘤寡灶型向多灶型轉(zhuǎn)移演進(jìn)的基因調(diào)控機(jī)制。
　　目的：建立與臨床相關(guān)的寡灶/多灶轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型并探索miR-200c對(duì)寡灶型轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞株體外特性的影響。
　　方法：首先，我們通過(guò)尾靜脈注射轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)并帶有GFP表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435建立與臨床相關(guān)的寡灶/

3、多灶轉(zhuǎn)移裸鼠模型，大約10~12周之后解剖裸鼠，用熒光鏡和470nm藍(lán)色激光手電筒能清晰看到體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，擬獲取穩(wěn)定的寡灶型轉(zhuǎn)移和多灶型轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株。由于 miRNA-200c在寡灶和多灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的表達(dá)差異明顯，故通過(guò)慢病毒感染建立穩(wěn)定高調(diào)miRNA-200c表達(dá)的寡灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（MDA-435-OL-200c），并同時(shí)建立陰性對(duì)照組（感染空質(zhì)粒LV3NC）和陽(yáng)性對(duì)照組（多灶型細(xì)胞株），通過(guò)CCK-8增殖曲線測(cè)定、瓊脂平板克隆

4、實(shí)驗(yàn)、transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明高調(diào) miRNA-200c對(duì)寡灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞體外特性的影響以及高調(diào)目的基因后寡灶型與多灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞株體外特性的不同和聯(lián)系。
　　結(jié)果：⑴根據(jù)寡灶型和多灶型轉(zhuǎn)移的臨床定義，我們于肺上獲取了疑似寡灶型轉(zhuǎn)移和多灶型轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株。并得到了除了肺以外的其他組織器官的寡灶和多灶的衍生細(xì)胞株，同時(shí)證實(shí)了我們建立的動(dòng)物模型的穩(wěn)定性以及獲取的寡灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞和多灶型轉(zhuǎn)移細(xì)胞的穩(wěn)定性。⑵慢病毒感染miRNA

5、-200c質(zhì)粒后，經(jīng)流式篩選 GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，熒光顯微鏡拍照驗(yàn)證及熒光定量PCR復(fù)檢miRNA-200c的高調(diào)，確保了病毒感染的有效性，成功建立穩(wěn)定高表達(dá)miRNA-200c的寡灶型細(xì)胞株。⑶瓊脂平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高調(diào)miRNA-200c的寡灶型細(xì)胞克隆斑形成率與陽(yáng)性對(duì)照多灶型細(xì)胞相當(dāng)，而高于陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑷CCK-8細(xì)胞增殖曲線測(cè)定，發(fā)現(xiàn)三個(gè)組別細(xì)胞增殖能力相當(dāng)，增殖曲線重合率高且倍增時(shí)間相近。⑸trans

6、well小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高調(diào) miRNA-200c后寡灶型細(xì)胞遷移能力上升，細(xì)胞活力與多灶型細(xì)胞相似，稍高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如遷移實(shí)驗(yàn)所述，P<0.05。
　　結(jié)論：①建立了與臨床相關(guān)的寡灶轉(zhuǎn)移與多灶轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，并獲取了穩(wěn)定的寡灶轉(zhuǎn)移細(xì)胞株和多灶轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。②寡灶型細(xì)胞株穩(wěn)定高調(diào) miRNA-200c后體外特性研究描述中有一定程度上呈現(xiàn)出多灶型細(xì)胞株的特性，這與我們之前短

7、期高調(diào)寡灶細(xì)胞miRNA-200c后的研究結(jié)果吻合，說(shuō)明 miRNA-200c有促進(jìn)已有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。③通過(guò)前期研究及本課題研究，miRNA-200c高調(diào)后對(duì)單個(gè)寡灶轉(zhuǎn)移細(xì)胞存活能力及遷移、侵襲能力均有促進(jìn)作用，說(shuō)明miRNA-200c可能成為寡灶型轉(zhuǎn)移腫瘤針對(duì)性治療的新靶點(diǎn)。④對(duì)這一過(guò)程的調(diào)控miRNA-200c可能不是唯一的一個(gè)基因，并且miRNA-200c對(duì)寡灶型轉(zhuǎn)移到多灶型轉(zhuǎn)移的調(diào)控也可能不只是一個(gè)靶基因，