腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、目的：喉聲門上型癌、喉咽癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，區(qū)域淋巴結(jié)是否有轉(zhuǎn)移是影響喉聲門上型癌、喉咽癌治療和預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前比較肯定的與喉聲門上型癌、喉咽癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的因素有：局部生長擴(kuò)散程度、部位、T分級(jí)和病理類型。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移與誘導(dǎo)基因組的不穩(wěn)定性有關(guān)，這種不穩(wěn)定性在表達(dá)各種不同類型的腫瘤中產(chǎn)生許多亞群、克隆和亞克隆。同一腫瘤中腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)異質(zhì)性，即多樣性和亞群。通過侵襲方式進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞絕大部分在短期內(nèi)死亡，

2、只有具有高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤才能逃逸種種因素，通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)繼發(fā)臟器，最終增殖生長形成轉(zhuǎn)移灶。但是腫瘤細(xì)胞進(jìn)入繼發(fā)臟器基質(zhì)并不意味轉(zhuǎn)移一定形成，只有當(dāng)侵入繼發(fā)臟器基質(zhì)的腫瘤細(xì)胞增殖形成轉(zhuǎn)移腫瘤灶并進(jìn)行性長大才真正實(shí)現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移。研究表明，在腫瘤的演變和進(jìn)展過程中，腫瘤克隆形成時(shí)出現(xiàn)的遺傳性變異連同宿主的選擇壓力可導(dǎo)致具有優(yōu)勢生長的新亞系出現(xiàn)，腫瘤異質(zhì)性和不同腫瘤細(xì)胞亞群具有不同轉(zhuǎn)移特性的觀點(diǎn)已經(jīng)得到公認(rèn)。研究發(fā)現(xiàn)多種參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程的基因表

3、達(dá)產(chǎn)物與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如與細(xì)胞黏附相關(guān)的CD44、上皮鈣依賴粘附素(E-Cadherin，E-Cad)；與轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的如血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrixmeoalloprotase9，MMP-9)；參與腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控的基因nm23-H1以及新近發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移信號(hào)分子開關(guān)蛋白PINCH等，均可作為判定腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的參考指標(biāo)。本研究將從轉(zhuǎn)移基因調(diào)控、腫瘤黏附、惡性浸潤三個(gè)方面，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方

4、法和流式細(xì)胞儀檢測方法，探討各種不同腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因編碼蛋白在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義，從而為喉聲門上型癌、喉咽癌轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后判定提供參考依據(jù)。 方法：標(biāo)本選自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2001年1月1日—2004年12月31日術(shù)前未經(jīng)治療的喉聲門上型癌、喉咽癌41例病人，其中喉聲門上型癌22例，喉咽癌19例；41例患者術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；男38例，女3例；中位年齡56

5、歲(43～72歲)。根據(jù)國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)標(biāo)準(zhǔn)(2002)確定TNM分期。臨床分期：Ⅲ期12例、Ⅳ期29例。41例均為鱗狀細(xì)胞癌，病理學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)22例、Ⅲ級(jí)11例。所有病例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶用于常規(guī)病理、免疫組化和流式細(xì)胞學(xué)檢測。標(biāo)本離體后2小時(shí)內(nèi)放入10％中性福爾馬林中固定24小時(shí)，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，所有標(biāo)本均經(jīng)兩位副高職以上的病理科醫(yī)生確定病理性質(zhì)和病理學(xué)分級(jí)。 采用S-P法對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組

6、織化學(xué)染色，觀察指標(biāo)為PINCH、nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9。結(jié)果判定：每例標(biāo)本以400倍光鏡下隨意選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均數(shù)求其陽性百分率作為結(jié)果。平均陽性細(xì)胞所占比例≤5％判定為陰性，陽性染色細(xì)胞＞5％判定為陽性。PINCH主要表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)和/或胞漿、胞核；nm23-H1和VEGF主要表達(dá)于胞漿；CD44主要表達(dá)于細(xì)胞膜；E-Cad和MMP-9主要表

7、達(dá)于細(xì)胞膜和/或胞漿。 流式細(xì)胞術(shù)觀察指標(biāo)為PINCH、nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9，取石蠟標(biāo)本切片(40μm厚)，網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞樣品。在對(duì)蛋白免疫熒光標(biāo)記物測定時(shí)，設(shè)一抗或二抗的本底對(duì)照和陰性對(duì)照。采用美國BeckmanCoulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)含量，F(xiàn)I=(瘤細(xì)胞表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度/正常對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)。熒

8、光指數(shù)(FI)可相對(duì)客觀的反映蛋白的表達(dá)程度。 結(jié)果：1.轉(zhuǎn)移調(diào)控相關(guān)蛋白PINCH、nm23-H1在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)(1)原發(fā)灶腫瘤PINCH蛋白陽性率為70.7％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為90.2％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P＜0.05)；原發(fā)灶腫瘤nm23-H1蛋白表達(dá)陽性率為34.1％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為26.8％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤PINCH蛋白表達(dá)與

9、喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級(jí)密切相關(guān)(P＜0.05)，臨床分期越晚、病理分化程度越低，PINCH蛋白表達(dá)陽性率及表達(dá)強(qiáng)度越高；而nm23-H1原發(fā)灶腫瘤蛋白表達(dá)與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級(jí)未見相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。 (2)流式細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞PINCH蛋白表達(dá)的相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI)分別為1.32±0.17和1.56±0.18，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異有顯著性(p＜0.05)。流式

10、細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞nm23-H1蛋白表達(dá)的相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI)分別為1.11±0.19和1.08±0.15，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析表明喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中PINCH、nm23-H1表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。 2.黏附相關(guān)因子CD44和E-cad蛋白在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)(1)原發(fā)

11、灶腫瘤CD44蛋白表達(dá)陽性率為75.1％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為85.4％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P＞0.05)；原發(fā)灶腫瘤E-Cad蛋白表達(dá)陽性率為31.7％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為26.8％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤CD44和E-cad蛋白表達(dá)與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級(jí)均未見相關(guān)(P＞0.05)。 (2)流式細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)的相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI

12、)分別為1.33±0.16和1.27±0.18，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。流式細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞E-Cad蛋白表達(dá)的相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI)分別為1.09±0.17和1.06±0.15，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶CD44陽性病例中，E-cad的陽性率(32.3％，22.9％)均低于CD44陰性的病例(90％，66.7％)，經(jīng)X2檢驗(yàn)(P

13、＜0.05)，表明CD44與E-cad在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。 3.腫瘤侵襲相關(guān)因子VEGF-C和MMP-9在喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)(1)原發(fā)灶腫瘤VEGF-C蛋白表達(dá)陽性率為90.2％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為92.7％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性(P＞0.05)；原發(fā)灶腫瘤MMP-9蛋白表達(dá)陽性率為80.5％，轉(zhuǎn)移灶腫瘤陽性率為85.4％，兩者比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無顯著性

14、(P＞0.05)。原發(fā)灶腫瘤VEGF-C和MMP-9蛋白表達(dá)與喉聲門上型癌、喉咽癌臨床分期和病理分級(jí)均未見相關(guān)(P＞0.05)。 (2)流式細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI)分別為1.33±0.15和1.29±0.15，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。流式細(xì)胞檢測原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的相對(duì)含量的平均熒光指數(shù)(FI)分別為1.30±0.17和1.3

15、1±0.22，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者間差異無顯著性(p＞0.05)。 (3)Person相關(guān)分析結(jié)果顯示，喉聲門上型癌、喉咽癌原發(fā)灶與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶VEGF-C和MMP-9蛋白表達(dá)之間均呈正相關(guān)(p＜0.05)。 結(jié)論：nm23-H1、CD44、E-Cad、VEGF-C、MMP-9在喉聲門上型癌和喉咽癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞中表達(dá)陽性率和表達(dá)強(qiáng)度未見差異，但轉(zhuǎn)移灶PINCH蛋白的表達(dá)陽性率和表達(dá)強(qiáng)度顯著高于原發(fā)灶，而且