大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移灶中邊緣群細(xì)胞的分離與鑒定.pdf

1、近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞理論備受人們關(guān)注,越來(lái)越多的研究結(jié)果表明：肝癌發(fā)生與肝干細(xì)胞之間關(guān)系密切，肝癌中可能存在肝癌干細(xì)胞。肝干/祖細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)的一些較為特異的標(biāo)志物，也常常能在肝癌細(xì)胞系中檢出。但由于以往對(duì)正常肝干細(xì)胞的解剖學(xué)定位及特異性標(biāo)志仍不明確，目前尚無(wú)肝癌干細(xì)胞分離成功的報(bào)道。自Goodel等首次報(bào)道了利用Hoechst33342染色分選邊緣群（side population,SP）可以從骨髓中富集造血干細(xì)胞以來(lái)，邊緣群細(xì)胞分選相繼

2、在多種實(shí)體瘤的腫瘤干細(xì)胞分離中獲得成功；本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)通過(guò)許多研究已證實(shí)利用邊緣群分選可以從多種肝癌細(xì)胞系及原發(fā)性肝癌標(biāo)本中富集到肝癌干細(xì)胞，而進(jìn)一步的研究顯示肝癌干細(xì)胞不僅是原發(fā)性肝癌的始動(dòng)細(xì)胞，也可能直接參與了肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，但目前還未見有從肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中分離出具有干細(xì)胞特征肝癌細(xì)胞的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究擬探討利用化學(xué)致癌劑二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型，采用邊緣群分選方法從大鼠肺轉(zhuǎn)移灶中分離干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞，并對(duì)其

3、干細(xì)胞特征、侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　1、大鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的建立將20只適齡雄性SD大鼠隨機(jī)平均分成4組，隨機(jī)抽取其中3組為實(shí)驗(yàn)組，剩余為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組大鼠均給予0.1％DEN生理鹽水灌胃，3次/周，共計(jì)四周；對(duì)照組大鼠予以正常喂養(yǎng)，所有大鼠均在20周后處死，解剖胸腹腔，觀察肝臟及肺部病變。
　　2、肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)切取肺部轉(zhuǎn)移灶，減碎成1mm3大小的組織塊，0.25％Ⅳ型膠原酶37℃下消化組織

4、塊10分鐘，Hank’s緩沖液洗滌組織塊3次，將組織塊接種至培養(yǎng)瓶，加入含10％胎牛血清的Wiliam’sE培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)換液。
　　3、肺轉(zhuǎn)移性肝癌組織邊緣群細(xì)胞分選0.25％胰酶－EDTA液將肝癌肺轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，參照Goodel等的文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行Hoechst33342染色，染色結(jié)束后向細(xì)胞懸液中分別加入PE標(biāo)記的c-kit和Sca-1抗體，在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)及分析。
　

5、　4、肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)在流式細(xì)胞儀上分析邊緣群細(xì)胞的同時(shí)，在PE通道分別檢測(cè)邊緣群及非邊緣群細(xì)胞c-kit、Sca-1的表達(dá)百分比。
　　5、SP及非SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的體外培養(yǎng)將分選得到的細(xì)胞分別接種至兩個(gè)預(yù)先包被好Matrigel的兩個(gè)培養(yǎng)皿中，并添加含HGF的無(wú)血清DMEMF12培養(yǎng)基，放至37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每隔兩天更換無(wú)血清DM

6、EMF12培養(yǎng)基一次。
　　6、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)板中制備0.6％底層瓊脂培養(yǎng)基，將分選得到的邊緣群和非邊緣群肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/ml，分別取兩組各40μl細(xì)胞懸液，在37℃與1ml0.3％頂層瓊脂培養(yǎng)基混勻后，立即澆入培養(yǎng)板中已凝固的底層瓊脂上，振勻，確保頂層培養(yǎng)基覆蓋整個(gè)底層培養(yǎng)基，置室溫下定型凝固；將培養(yǎng)皿放入37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，計(jì)數(shù)克隆

7、數(shù)目；重復(fù)5次，計(jì)算平均克隆數(shù)目，Studentt檢驗(yàn)比較SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞平均克隆數(shù)目。
　　7、自我增殖實(shí)驗(yàn)將分選得到的SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞分別在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，再次予以Hoechst33342染色后，分析兩組細(xì)胞中邊緣群細(xì)胞的含量。
　　8、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)板中制備Martrigel膠，將肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細(xì)胞、non-SP細(xì)胞、未分選肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞分別加入含培養(yǎng)液及趨化因子的該

8、培養(yǎng)板中，37℃條件下培養(yǎng)12小后，鏡下觀察計(jì)算平均穿膜細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中獲得的穿膜細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)用±xs表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行ANOVA分析。
　　9、體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)將分選得到的SP肝癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞和non-SP肝癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞用無(wú)菌技術(shù)接種至裸鼠右側(cè)背部皮下，每組各10只裸鼠，每只裸鼠的接種細(xì)胞總數(shù)經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分選均為2×104個(gè)，每隔3天觀察皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況，一周后處死裸鼠,稱量皮下腫瘤重量及體積。
　　結(jié)

9、果：
　　1、大鼠肝癌晚期出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)情況良好，病理解剖各組織器官未見異常；實(shí)驗(yàn)組大鼠處死后解剖發(fā)現(xiàn)：肝臟均出現(xiàn)不同程度的肝硬化，肝臟表面滿布癌結(jié)節(jié)，其中2只大鼠雙肺表面可見粟粒樣轉(zhuǎn)移性癌結(jié)節(jié)，部分肺組織經(jīng)固定包埋切片后，行H.E染色鏡檢證實(shí)為肝癌肺轉(zhuǎn)移灶。
　　2、肺轉(zhuǎn)移灶肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)的鏡下觀察組織塊接種至培養(yǎng)瓶24小時(shí)后，可見組織塊邊緣有大量細(xì)胞釋放；在后續(xù)培養(yǎng)中陸續(xù)可見到大量細(xì)胞從組織塊中釋放、貼壁、伸

10、展成上皮樣細(xì)胞，培養(yǎng)7天去除組織塊后，在原植塊位置可見到明顯的上皮樣細(xì)胞島形成。
　　3、肺轉(zhuǎn)移性肝癌SP細(xì)胞的分離細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)的結(jié)果：以Hoechstred為X軸、Hoechstblue為Y軸所作的二維散點(diǎn)圖中，在遠(yuǎn)離肝癌細(xì)胞集中區(qū)域的左下角部分，可見到一小部分光點(diǎn)聚集，它們表現(xiàn)為低Hoechstblue和低Hoechstred的特征，與其它絕大多數(shù)肝癌細(xì)胞的散射熒光特征明顯不同，該群位

11、于邊緣的“特殊”細(xì)胞即“邊緣群細(xì)胞”(SP細(xì)胞)。
　　4、肺轉(zhuǎn)移性肝癌SP細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物SP細(xì)胞表面c-kit表達(dá)率為85％，Sca-1表達(dá)率為75％，而non-SP細(xì)胞表面c-kit及Sca-1表達(dá)率分別僅為8％和3％。
　　5、具有SP和non-SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞在體外無(wú)血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)SP表型的肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中仍保持有增殖的能力，而non-SP細(xì)胞組未觀察到明顯的增殖現(xiàn)象;培養(yǎng)10天后，

12、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)SP表型的肝癌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中形成了多個(gè)島嶼樣的細(xì)胞克隆;而non-SP肝癌細(xì)胞組此時(shí)仍未見有顯著的增殖，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有未貼壁的死亡細(xì)胞。
　　6、肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力高于non-SP細(xì)胞SP肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，大部分細(xì)胞形成了明顯的細(xì)胞克隆，細(xì)胞克隆呈桑椹樣，每個(gè)克隆由16-20個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞呈透亮的球形，平均克隆形成率達(dá)到了69.90％；而non-SP表型

13、的肺轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中未能形成明顯的細(xì)胞克隆，大部分細(xì)胞趨于凋亡、崩解，該組細(xì)胞的平均克隆形成率僅為15.25％。t=20.46，n=5，P<0.01。
　　7、自我增殖實(shí)驗(yàn)將上述SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞用Hoechst33342染色并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，SP細(xì)胞組仍能檢測(cè)到特征性的SP細(xì)胞群，而非SP肝癌細(xì)胞組在體外無(wú)血清條件下培養(yǎng)后，不僅無(wú)法再檢測(cè)到特征性的SP細(xì)胞群,且在流式細(xì)胞檢測(cè)中出現(xiàn)了明顯的死亡細(xì)胞群。

14、r>　　8、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移肝癌SP細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目均明顯高于non-SP細(xì)胞及未分選細(xì)胞，顯示肝癌肺轉(zhuǎn)移SP細(xì)胞體外侵襲能力強(qiáng)于non-SP細(xì)胞及未分選細(xì)胞。F=9.519481，P=0.002142。
　　9、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞種植一個(gè)月后，SP細(xì)胞種植組裸鼠成瘤率，瘤體重量及體積明顯高于non-SP細(xì)胞種植組。SP細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯高于non-SP細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　來(lái)源于肝癌肺轉(zhuǎn)

15、移腫瘤組織的SP肝癌細(xì)胞群中富含具有干細(xì)胞特征的“特殊”細(xì)胞，這些“特殊”的細(xì)胞既具有形成和重建肝癌組織的能力，也具有較強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力，還通過(guò)自我增殖保持自我更新，它們?cè)诟伟┓无D(zhuǎn)移組織中發(fā)揮了類似正常組織中干細(xì)胞的角色和作用。肝癌肺轉(zhuǎn)移組織可能具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，其中包含肝癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞，利用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選的方法可得到具備肝癌干細(xì)胞特征的SP細(xì)胞，SP細(xì)胞相對(duì)于肝癌肺轉(zhuǎn)移組織中的non-SP細(xì)胞具備較強(qiáng)