EGFR表達和KRAS突變在鼻咽癌原發(fā)灶和淋巴結轉移灶的差異以及Cetuximab聯合放化療對鼻咽癌細胞株作用機制的實驗研究.pdf

1、本論文的目的在于通過分別檢測鼻咽癌腫瘤組織EGFR蛋白表達以及鼻咽癌患者相配對的原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶的EGFR蛋白表達和KRAS突變，探討鼻咽癌腫瘤組織EGRR蛋白表達與鼻咽癌患者生存預后的關系以及EGFR蛋白表達和KRAS突變在鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶的差異及臨床意義；通過體內外實驗，了解EGFR靶向藥物Cetuximab聯合放療和順鉑對鼻咽癌細胞株的作用機制，探討Cetuximab聯合放化療治療鼻咽癌患者的臨床應用前景和價

2、值。
　　 第一章 EGFR在鼻咽癌組織中的表達和臨床意義
　　 目的:
　　 采用免疫組化染色的方法檢測EGFR蛋白在鼻咽癌患者腫瘤組織中的表達，并分析其與鼻咽癌的臨床特征和生存預后的關系，為鼻咽癌的靶向治療提供初步依據。
　　 方法:
　　 本研究選取1999年1月至12月全年在中山大學腫瘤防治中心放療科治療的初治鼻咽癌病例，其中臨床和隨訪資料完整且能在我院病理科獲取鼻咽癌組織蠟塊標本病例23

3、5例。所有患者均病理證實為未分化非角化性癌。用免疫組化方法檢測鼻咽癌組織中EGFR蛋白的表達情況，結合患者的臨床特征及隨訪資料，對患者的無瘤生存時間和總生存時間等進行單因素Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox回歸分析。結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析和處理。
　　 結果:
　　 235例鼻咽癌患者組織中EGFR陽性表達率為89.4％，陽性表達部位主要在細胞膜。EGFR表達與T分期、N分期相關，而與年

4、齡、性別及臨床分期均無關。單因素Kaplan-Meier生存分析表明本組患者中EGFR表達高低不同者，其無復發(fā)生存時間、無轉移生存時間、無瘤生存時間和總生存時間的差別均無統(tǒng)計學差異；多因素Cox回歸分析表明鼻咽癌組織EGFR高表達不是本組患者預后的獨立影響因素；
　　 結論:
　　 EGFR在鼻咽癌組織中陽性表達率高達89.4％，提示EGFR有可能作為鼻咽癌靶向治療的有效靶點。EGFR的表達與鼻咽癌的T分期、N分期相關，

5、而與年齡、性別和臨床分期無顯著相關，與預后無顯著相關。鼻咽癌組織EGFR高表達不是預后的獨立影響因素。
　　 第二章 EGFR表達和KRAS突變在鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶的對比研究
　　 目的:
　　 通過分別比較EGFR蛋白表達和KRAS突變在鼻咽癌患者的原發(fā)灶和相應頸部淋巴結轉移灶中的情況，探討兩者在鼻咽原發(fā)灶和轉移灶的差異，為臨床上靶向藥物治療鼻咽癌提供分子預測的初步依據。
　　 方法:

6、>　　 收集中山大學腫瘤防治中心1997年1月至2003年7月治療的86例初治并同時進行鼻咽部和頸部淋巴結轉移灶活檢的鼻咽癌患者。分別檢測鼻咽原發(fā)灶和相應頸部淋巴結轉移灶EGFR蛋白表達和KRAS突變情況，分別比較EGFR蛋白表達和KRAS突變在鼻咽原發(fā)灶和頸淋巴結轉移灶的情況。雙邊P<0.05被認為是有統(tǒng)計學意義。應用統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析數據。
　　 結果:
　　 86例配對的鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶中

7、，EGFR的陽性表達率分別為73.3％和60.5％，兩者之間的表達存在顯著性差異(p=0.001)；EGFR在原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶之間總的變化率為29.1％。86例配對的鼻咽癌原發(fā)灶和頸部淋巴結轉移灶中，共檢測了57例患者的KRAS突變情況，其中12例(21.1％)鼻咽癌原發(fā)灶存在KRAS突變，4例(7％)頸部淋巴結轉移灶存在KRAS突變，主要是第2外顯子13密碼子突變，4例患者的原發(fā)灶和轉移灶同時存在KRAS突變。
　　

8、結論:
　　 鼻咽癌患者的原發(fā)灶和頸淋巴結轉移灶均存在不同的EGFR蛋白表達和KRAS基因突變，為進一步研究靶向藥物的臨床應用篩選分子預測指標提供依據。
　　 第三章 EGFR靶向藥物Cetuximab聯合照射和順鉑對鼻咽癌細胞株作用機制的體外實驗研究
　　 目的:
　　 通過體外實驗，探討Cetuximab聯合照射和細胞毒藥物順鉑對鼻咽癌的作用機制和臨床價值。
　　 方法:
　　 選擇人

9、鼻咽癌細胞株CNE2，MTT法測定Cetuximab、順鉑以及兩藥聯合的細胞毒作用；采用Annexin V-FITC and Propidium Iodide(PI)雙染法通過流式細胞儀檢測Cetuximab聯合照射和順鉑處理后的早期細胞調亡和細胞周期情況；提取用Cetuximab聯合照射和順鉑處理后的細胞總蛋白，用免疫印跡的方法分析PI3K/Akt信號通路的關鍵酶Akt、p-Akt(Ser473)，MEK/MAPK信號通路的關鍵酶ER

10、K1/2、p-ERK1/2蛋白以及凋亡死亡底物PRAP的表達情況。
　　 結果:
　　 Cetuximab對鼻咽癌細胞株CNE2的生長有一定的抑制作用。Cetuximab聯合順鉑作用后，抑制鼻咽癌細胞生長的作用增強。Western blot分析結果示，照射、細胞毒藥物順鉑對EGFR、AKT、ERK1/2、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平影響不明顯，Cetuximab無論單用或聯合順鉑和或照射應用對CNE2細胞株的p-

11、EGFR、p-AKT、p-ERK1/2蛋白水平均有下調作用，而對EGFR、AKT和ERK1/2的總量影響不大。與單用Cetuximab相比，Cetuximab聯合照射或順鉑可以進一步下調p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表達，以作用48h后更明顯。而Cetuximab聯合照射和順鉑幾乎完全抑制p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2的表達。
　　 結論:
　　 單藥Cetuximab在體外對CNE2細胞株

12、的增殖都具有一定的抑制作用，聯合順鉑抑制作用增強顯。單藥Cetuximab能誘導CNE2細胞發(fā)生凋亡，聯合照射和細胞毒藥順鉑作用，誘導CNE2細胞株細胞凋亡的作用更強。Cetuximab可抑制胞內信號傳導相關的AKT及ERK通路，Cetuximab聯合照射和順鉑可導致胞內相關信號傳導通路產生更明顯抑制。
　　 第四章 Cetuximab聯合照射和順鉑對人鼻咽癌移植瘤荷瘤裸鼠模型作用的研究
　　 目的:
　　 觀察

13、Cetuximab單用和或聯合照射及順鉑對鼻咽癌荷瘤裸鼠移植瘤生長有無抑制作用，以及裸鼠對Cetuximab聯合照射和或順鉑的耐受性，探討Cetuximab聯合照射和細胞毒藥物順鉑在體內對鼻咽癌細胞生長的影響和治療價值，為臨床研究提供實驗依據。
　　 方法:
　　 用CNE2細胞在裸鼠身上建立鼻咽癌移植瘤模型，移植瘤荷瘤裸鼠總共80只，隨機分為8組，分別為對照組、單純照射組，單藥Cetuximab治療組，Cetuxima

14、b聯合照射治療組，單藥DDP治療組，DDP聯合照射組，Cetuximab聯合DDP治療組，Cetuximab聯合照射和DDP治療組，每組各10只。Cetuximab治療組每間隔3天用含Cetuximab1 mg的藥物原液0.5ml，腹腔內注射，總共給藥3次，第一次給藥在放療和DDP注射前6小時給藥；DDP治療組每次用含5mg/kg DDP腹腔內注射，隔天給藥，連續(xù)給藥3次。照射組每天照射2Gy，連續(xù)照射6天。期間每周2次用毫米游標卡尺測

15、量裸鼠腫瘤的長、寬最大垂直直徑的大小，記錄并計算各組裸鼠治療前體重和腫瘤體積，治療后的平均體重和腫瘤體積。結束用藥和照射后觀察3周后處死動物，取出腫瘤組織，把移植瘤用石蠟包埋以便免疫組化分析。
　　 結果:
　　 治療前各組裸鼠體重和腫瘤體積均無顯著性差異；治療過程中未觀察到明顯的裸鼠進食、活動減少和皮疹等不良反應；治療后各組裸鼠腫瘤體積和重量均較對照組減少，腫瘤生長受到一定的抑制，Cetuximab聯合照射和順鉑，能更

16、明顯抑制腫瘤的生長，與對照組裸鼠相比具有統(tǒng)計學差異。
　　 結論:
　　 CNE2鼻咽癌細胞荷瘤裸鼠對Cetuximab聯合放療和細胞毒藥物順鉑治療的耐受性較好；Cetuximab聯合照射或順鉑對CNE2細胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，三者聯合能明顯抑制腫瘤生長，但Cetuximab與DDP和/或照射合用未能顯著增強DDP和/或照射聯合對CNE2細胞裸鼠移植瘤模型的效果。
　　 結論:
　　 1.E

17、GFR在鼻咽癌組織中高表達，與T分期和N分期相關，而與年齡、性別和臨床分期無關。
　　 2.EGFR的表達與鼻咽癌的預后無明顯相關，EGFR高表達不是鼻咽癌預后的獨立影響因素。
　　 3.EGFR蛋白表達和KRAS突變鼻咽癌原發(fā)病灶和轉移病灶之間存在差異。鼻咽癌KRAS突變主要是第2外顯子13號密碼子。
　　 4.Cetuximab單藥能抑制CNE2的增殖，但抑制作用并不明顯，聯合順鉑作用，其抑制強度增加，具有協

18、同效應。
　　 5.Cetuximab可誘導CNE2細胞凋亡，聯合照射和順鉑，其誘導細胞凋亡的作用更明顯。
　　 6.Cetuximab可抑制p-EGFR的活化而導致胞內信號傳導AKT及ERK通路的抑制，聯合照射和順鉑作用，其抑制通路分子的作用更明顯。
　　 7.CNE2細胞荷瘤裸鼠對Cetuximab聯合照射和順鉑治療的耐受性較好。
　　 8.Cetuximab聯合照射或順鉑對CNE2細胞裸鼠移植瘤模型