新型海洋酯酶資源的挖掘及酯酶E22的生化特性與催化機(jī)制研究.pdf

1、酯類水解酶包括脂肪酶和酯酶，廣泛存在于自然環(huán)境中。微生物來源的酯類水解酶具有便于工業(yè)生產(chǎn)、易純化等優(yōu)點(diǎn)，使其被廣泛應(yīng)用到工業(yè)、食品及醫(yī)藥行業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的新型酯類水解酶得到發(fā)現(xiàn)和研究，為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。海洋環(huán)境中物理、化學(xué)因素的特殊性和復(fù)雜性，造就了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態(tài)功能上的多樣性，從而有利于獲取新穎的、性質(zhì)獨(dú)特的酯類水解酶。本文中，我們通過對(duì)大西洋深海沉積物進(jìn)行功能

2、宏基因組篩選，獲得了一個(gè)類似于HTA的新型酯酶基因E22。通過生化、結(jié)構(gòu)和突變分析，我們闡明了酯酶E22的生化性質(zhì)、底物識(shí)別與催化的分子機(jī)制，酯酶E22及其同源序列構(gòu)成HTA家族中新的亞家族的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，通過對(duì)兩株海洋細(xì)菌的基因組進(jìn)行序列篩選再結(jié)合功能篩選，我們還獲得了兩個(gè)新型酯酶基因EstD和EstH。
　　一、新型海洋酯酶基因的功能篩選
　　本文構(gòu)建了大西洋深海沉積物的宏基因組文庫，該文庫含有17，000個(gè)fosmi

3、d克隆。通過對(duì)該文庫進(jìn)行功能篩選，獲得了一個(gè)新的酯類水解酶基因E22。序列分析顯示，E22與已報(bào)道的酯類水解酶沒有結(jié)構(gòu)相似性，但與多個(gè)細(xì)菌來源的HTA具有很高的序列相似性。同時(shí)，我們還對(duì)兩株海洋細(xì)菌的基因組進(jìn)行了序列篩選和功能篩選，獲得了兩個(gè)序列新穎的酯類水解酶基因EstD和EstH。對(duì)E22、EstD和EstH進(jìn)行異源表達(dá)和活性分析表明，E22、EstD和EstH均為酯酶。因此，我們從海洋沉積物和細(xì)菌基因組中獲得了三個(gè)新的酯酶基因。<

4、br>　　二、酯酶E22的酶學(xué)性質(zhì)
　　在Escherichia Coli BL21(DE3)中對(duì)E22進(jìn)行了表達(dá)和分離純化，并對(duì)重組酯酶E22進(jìn)行了生化性質(zhì)分析。酯酶E22對(duì)碳鏈長度在2～6個(gè)碳原子的短鏈酯類底物表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解活性，最適底物為pNPC4。以pNPC4為底物時(shí)，純化的E22的比活力為1720 U/mg，Km值為57.12μM，kcat/Km值為3.8×104 s-1 mM-1。最適反應(yīng)溫度是60℃，最適pH為9.

5、0，E22對(duì)NaCl的耐受性較弱。金屬離子和EDTA對(duì)E22的酶活影響很小，表明E22在催化過程中可能不需要金屬離子的參與。與其他酯酶一樣，E22的酶活性受Phenylmethylsμlfonyl fluoride(PMSF)抑制。
　　三、酯酶E22的催化機(jī)制分析
　　為了研究酯酶E22的底物識(shí)別與催化機(jī)制，我們解析了E22及其突變體L374D的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為2.3(A)和1.5(A)，并將分子pNPC4對(duì)接到L3

6、74D結(jié)構(gòu)中。 E22在溶液中和晶體中均形成二聚體。E22單體蛋白含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)Lid結(jié)構(gòu)域和一個(gè)α/β水解酶結(jié)構(gòu)域。E22的催化三聯(lián)體由Ser175、Asp340和His373構(gòu)成，這三個(gè)催化殘基均位于α/β水解酶結(jié)構(gòu)域。通過分析突變體L374D與pNPC4底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)并結(jié)合突變和生化分析，我們揭示出E22的催化機(jī)制。底物的降解分兩步進(jìn)行。在第一步反應(yīng)中，底物進(jìn)入E22的底物結(jié)合腔后其苯環(huán)上的硝基即被Arg294和Ser72

7、固定。同時(shí)，一個(gè)電子經(jīng)His373從Asp340傳遞給Ser175并將其激活，Ser175對(duì)底物上的羧基碳發(fā)起親核攻擊。形成一個(gè)酰基-酶(acyl-enzyme)中間產(chǎn)物的四面體，該四面體通過與氧離子洞殘基Phe71和Met176上的主鏈N原子發(fā)生相互作用而得到穩(wěn)定。隨后His373貢獻(xiàn)一個(gè)質(zhì)子給中間產(chǎn)物，形成對(duì)硝基苯酚并被釋放到溶液中。伴隨著“丁?；腟er175”形成，第一步反應(yīng)結(jié)束。在第二步反應(yīng)中，四面體構(gòu)型依然由“氧離子洞”穩(wěn)定

8、。此時(shí)，His373從周圍的水分子中奪取一個(gè)質(zhì)子，經(jīng)活化產(chǎn)生的OH-對(duì)四面體中間產(chǎn)物上的羧基氧發(fā)起親核攻擊，從而釋放丁酸，E22又回到活性狀態(tài)。
　　四、酯酶E22在底物識(shí)別方面區(qū)別于其它兩個(gè)HTA亞家族的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
　　底物特異性分析表明，雖然酯酶E22在序列和結(jié)構(gòu)上均與HTA家族蛋白很相似，但E22可以催化長達(dá)六個(gè)碳原子的酯酰鏈水解，并且不具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性。為了研究酯酶E22與其它兩個(gè)HTA亞家族的不同，我們對(duì)三者的結(jié)構(gòu)

9、進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明這三類酶具有相同的催化三聯(lián)體，但是底物結(jié)合腔存在明顯的差異。酯酶E22的底物結(jié)合腔表面含有更多的正電荷，這不利于乙酰-CoA疏水部分的結(jié)合。并且，E22缺少了轉(zhuǎn)移酶中穩(wěn)定乙酰-CoA的4個(gè)保守殘基。?；D(zhuǎn)移酶中結(jié)合Homoserine的關(guān)鍵帶電荷氨基酸殘基在E22中被替換成了疏水殘基。E22的催化腔的疏水部分更深一些，使E22可以容納長至六個(gè)碳原子的酯酰鏈，這些結(jié)構(gòu)上的不同，使E22異于其它兩個(gè)HTA亞家族類群。