枇杷果膠酯酶基因克隆及表達(dá)特性分析.pdf

1、在植物的授粉受精過程中，花粉管是雄性生殖單位的載體，它攜帶精細(xì)胞并將其傳遞給卵細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)精卵結(jié)合并完成受精作用，故研究花粉管的萌發(fā)和生長調(diào)控機(jī)制，對研究植物的授粉受精調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。
　　果膠酯酶（Pectin methylesterase，PME）是一種重要的果膠酶，能催化植物細(xì)胞壁上的果膠脫去甲氧基生成果膠酸和甲醇，PME對細(xì)胞壁的組成與降解、種子萌發(fā)、果實(shí)成熟以及花粉發(fā)育和花粉管的生長等植物的生長發(fā)育過程起重要的作

2、用。目前的研究證實(shí)花粉管的生長為頂端極性生長，但是對于其生長過程的分子調(diào)控機(jī)制尚不很清楚。而花粉管的頂端只含單一果膠質(zhì)層，故花粉管壁的果膠質(zhì)代謝和變化在花粉管的頂端生長中起重要的作用。目前，關(guān)于PME調(diào)控植物花粉的發(fā)育和花粉管生長的研究已成為植物生殖生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
　　三倍體枇杷在減數(shù)分裂、授粉受精及早期胚胎發(fā)育過程中均存在異常，造成了大多數(shù)三倍體花粉生活力低、萌發(fā)率低、花粉管不能完成穿柱到達(dá)珠孔、到達(dá)珠孔后不能完成融

3、合、融合后合子不能正常發(fā)育等現(xiàn)象。因此，深入探討三倍體枇杷的育性機(jī)理，對明確三倍體的無核機(jī)理和利用三倍體創(chuàng)制新的種質(zhì)資源具有重要的意義。
　　為此，本實(shí)驗(yàn)在三倍體和二倍體花器官的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜分析的基礎(chǔ)上，從中挑選了與花粉管發(fā)育相關(guān)的差異PME同源基因序列，通過cDNA快速末端擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，從枇杷花器官中克隆PME家族基因的全長，并進(jìn)行基本的生物信息學(xué)分析，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)分析P

4、ME家族基因在二倍體枇杷與三倍體枇杷授粉前后的花器官中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步的分析它們在花器官中不同部位的表達(dá)情況，分析三倍體枇杷育性變化規(guī)律，為開展花粉管生長的調(diào)控機(jī)理研究提供分子生物學(xué)依據(jù)。本研究取得的主要結(jié)果如下:
　　(1)利用RACE技術(shù)首次從枇杷中克隆了2條PME基因的全長序列，去掉UPM接頭序列，其全長均為2201bp，其中5'端非翻譯區(qū)為90bp，3'非翻譯區(qū)為374bp，且其內(nèi)包含1個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，長

5、度為1737bp，經(jīng)序列分析，這兩個(gè)序列有5個(gè)位點(diǎn)的堿基存在差異，但其推導(dǎo)的氨基酸序列只有兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸存在差異，即第226位點(diǎn)和418位點(diǎn)。通過NCBI在線工具BALST比對發(fā)現(xiàn)該這兩個(gè)序列均屬于果膠酯酶家族基因。遂將其命名為EjPPME1和EjPPME2。
　　(2)運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了Ej PPME1和EjPPME2的同源性，并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列，預(yù)測了其編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明EjPPME2的同源

6、性與Ej PPME1一致，二者編碼的蛋白與碧桃(Prunus persica)的一個(gè)推定蛋白相似性高達(dá)81％，其次與葡萄、草莓的同源性也比較高。此外，它們都含有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即PMEI結(jié)構(gòu)域和PME結(jié)構(gòu)域。EjPPME1和EjPPME2編碼的蛋白的理化性質(zhì)只有細(xì)微的差異，它們的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)均以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，二者均是具疏水性的跨膜蛋白，且定位于分泌通路，即分泌到細(xì)胞周質(zhì)。
　　(3)利用Real-time PCR技術(shù)，對EjP