海洋新型酯酶的克隆、表達(dá)及應(yīng)用.pdf

1、海洋來源的酯酶通常具有與海洋環(huán)境相關(guān)的優(yōu)良性質(zhì)，例如溫度穩(wěn)定性、耐鹽性、耐堿性、耐低溫、以及優(yōu)異的手性選擇性等等，因此，從海洋微生物中篩選出獨(dú)具特性的酯酶就成了開發(fā)新型工業(yè)酶制劑的一個(gè)重要方向。(R）-3-（4-氟苯基）戊二酸單甲酯((R)-3-MFG)是抗抑郁藥帕羅西汀合成中的重要前體，但目前的合成方法在工業(yè)化生產(chǎn)中尚存在一定的局限性。
　　本文對(duì)來自于PelagibacteriumhalotoleransB2T基因組的新型酯酶

2、進(jìn)行了克隆、異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的研究，并將這些酯酶用于手性選擇性水解3-(4-氟苯基)戊二酸二甲酯(3-DFG)合成(R)-3-MFG。
　　首先，本文從海洋耐鹽細(xì)菌P.halotoleransB2T基因組中，成功地克隆了11個(gè)新型酯酶基因。在E.coliRosseta(DE3)中成功地對(duì)pe2、pe8、pe9、pel0、pe11這5個(gè)酯酶基因進(jìn)行了可溶性表達(dá);此外，通過共表達(dá)分子伴侶質(zhì)粒pGro7，在E.coliBL21(DE3

3、)中實(shí)現(xiàn)了pe6、pe7酯酶基因的可溶性表達(dá)。
　　其次，將獲得的7個(gè)新型酯酶基因用于手性選擇性水解3-DFG來合成(R)-3-MFG。通過酶的篩選，發(fā)現(xiàn)酯酶PE8對(duì)底物3-DFG表現(xiàn)出較高的活性與手性選擇性。考察了反應(yīng)中有機(jī)助溶劑種類、有機(jī)助溶劑濃度、緩沖液pH、緩沖液的離子強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間與溫度以及粗酶對(duì)水解反應(yīng)的影響，確定最優(yōu)反應(yīng)條件為:以0.6M的pH8.0磷酸鈉緩沖液作為溶劑，17.5％(v/v)的1，4-二氧六環(huán)作為助溶

4、劑，在200rpm，30℃下反應(yīng)36h。在上述最優(yōu)反應(yīng)條件下，(R)-3-MFG的ee值為71.6％，產(chǎn)率為73.2％。本文首次報(bào)道了海洋來源的酯酶在合成抗抑郁藥帕羅西汀手性中間體中的應(yīng)用。
　　最后，對(duì)酯酶PE8進(jìn)行了基因序列的分析以及酶學(xué)性質(zhì)的研究。分析表明，酯酶PE8的基因大小為660bp，編碼219個(gè)氨基酸，理論分子量為23.19kDa，理論pI為4.73。酯酶PE8與來自于Parvibaculumlavamentivor

5、ansDS-1的酯酶的相似度最高，達(dá)到46％，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析其有可能是屬于第六家族水解酶的新成員。PE8的最適催化底物為對(duì)硝基苯酚乙酸酯(C2)，屬于脂類水解酶中的酯酶。PE8能在許多金屬陽離子存在的情況下保持穩(wěn)定，但Ni2+、Zn2+與Cu2+對(duì)酯酶的活性有抑制作用。PE8水解對(duì)硝基苯酚乙酯的最適溫度為45℃，并且在0℃以及65℃仍具有一定的催化活性，PE8對(duì)于對(duì)硝基苯酚辛酯的最適催化pH為9.5，并且在pH11.0時(shí)仍然有催化活性。