海洋微生物新穎脂肪酶酶學性質(zhì)及其催化合成乙酸肉桂酯的研究.pdf

1、乙酸肉桂酯是一種重要的酯類香料，由于從天然產(chǎn)物中提取的量極少而不能滿足需要，大部分乙酸肉桂酯是利用化學法進行合成的。但化學法生產(chǎn)成本高，提取工藝繁瑣，環(huán)境污染大。脂肪酶是一種酯鍵水解酶，能夠催化酯化、醇解、轉(zhuǎn)酯等多種反應(yīng)，在食品、醫(yī)藥、飼料、生物化工、洗滌、紡織等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。利用脂肪酶的催化特性，可在有機相中催化合成乙酸肉桂酯，替代化學法實現(xiàn)綠色合成。
　　本論文通過生物信息學軟件FramePlot4.0beta和Signal

2、P4.1 Server的分析，在一株深海來源微生物Streptomyces sp. SCSIO13580的基因組中篩選到了17個脂肪酶基因，并用軟件Primer Premier5為每個脂肪酶基因設(shè)計了兩條引物。利用設(shè)計并合成的引物對17個脂肪酶進行了特異性擴增。將擴增出的脂肪酶基因連接到 pET-28a(+)質(zhì)粒上，導入 BL21（DE3）感受態(tài)細胞中進行表達，經(jīng)SDS-PAGE凝膠檢驗，有14個脂肪酶成功表達，表達成功率為82.4％。

3、
　　將14個脂肪酶制備成酶粉，用酶粉在有機相中進行了乙酸肉桂酯的合成，篩選出了轉(zhuǎn)化率最高的脂肪酶L-1。利用鎳柱親和層析的方法，對脂肪酶L-1進行了純化。通過生物信息學方法和工具的應(yīng)用，對脂肪酶L-1的基因序列進行了進一步的分析。脂肪酶L-1的基因序列含有1005個堿基，編碼334個氨基酸，與GenBank數(shù)據(jù)庫最相近的蛋白質(zhì)的相似度為51%，是一個新穎脂肪酶。通過軟件DNAMAN的對比，找到了脂肪酶的催化中心Ser-Asp-H

4、is三亞基結(jié)構(gòu)和保守序列GXSXG，并用軟件MEGA6構(gòu)建了脂肪酶L-1的進化樹。
　　用對硝基苯酚酯法對脂肪酶L-1進行了酶學性質(zhì)研究。脂肪酶L-1對對硝基苯酚己酸酯的催化活性最高，其最適作用pH為8.0，但在pH8.5的緩沖溶液中穩(wěn)定性最好；最適反應(yīng)溫度為40℃，在高于40℃的環(huán)境中處理1 h后，酶活力顯著下降，在20-40℃的范圍內(nèi)，酶活性隨溫度升高下降明顯；1 mmol/L的Li+、Mg2+能夠激活酶的活性，甲醇、乙醇、異

5、丙醇、異丁醇等有機溶劑可大幅提高酶活性，并且對多種有機溶劑和表面活性劑具有很好的耐受性。在最適條件下，脂肪酶L-1的酶活力為51.5 U/mg。
　　在單因素實驗的基礎(chǔ)上，考察了?；w、溶劑、肉桂醇/乙酸乙烯酯摩爾濃度之比、溫度等因素對脂肪酶L-1合成乙酸肉桂酯的活性的影響，得到的最佳反應(yīng)條件是：以乙酸乙烯酯為?；w，以正己烷為溶劑，肉桂醇/乙酸乙烯酯的摩爾濃度之比為1:6，反應(yīng)溫度為40℃，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化率達到48.3%，酶粉