具有手性選擇性酯酶-脂肪酶的篩選、催化特點(diǎn)及應(yīng)用研究.pdf

1、手性是自然界最重要的屬性之一，分子手性識(shí)別在生命活動(dòng)中起著極為重要的作用。同一化合物的兩個(gè)對(duì)映體之間不僅具有不同的光學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，而且它們具有不同的生物活性。獲得手性化合物的傳統(tǒng)方法之一是利用拆分試劑對(duì)外消旋底物進(jìn)行拆分或者不對(duì)稱水解。然而，使用化學(xué)拆分試劑對(duì)消旋化合物進(jìn)行拆分需要耗用大量的手性拆分試劑，成本壓力大且環(huán)境不友好。酶催化下的不對(duì)稱合成及拆分反應(yīng)具有環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和以及選擇性好等特點(diǎn)。目前的手性化合物制備方法中，應(yīng)

2、用較多的主要是脂肪酶，但脂肪酶昂貴的價(jià)格限制了其規(guī)?；瘧?yīng)用。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直尋找用以替代脂肪酶的酯酶，在具有類似的催化能力和催化特性時(shí)，使用制備成本較低的酯酶替代脂肪酶使得低成本制備手性化合物更具可行性。
　　 本文重點(diǎn)研究，兩類手性化合物（S)-3-羥基戊二酸單酯類化合物和手性1-苯乙醇類化合物的生物制備，手性酯酶/脂肪酶的篩選及催化特點(diǎn)。以其為主線，展開了下面六個(gè)方面的工作，具體為：
　　 (a)選擇適合反應(yīng)的生物

3、酶催化劑，首先需要對(duì)酶進(jìn)行篩選。利用已經(jīng)建立的酶庫(kù)，我們開發(fā)了一個(gè)基于真實(shí)底物的熒光高通量篩選方法。相對(duì)于目前的高通量篩選體系，該篩選體系具有可靠、精確和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。通過已建立的高通量篩選方法，我們篩選到了一種高活性和高選擇性的水解酶(酯酶Escherichia coli BioH)。
　　 (b)將篩選得到的酯酶應(yīng)用到仲醇類化合物的拆分中。該酶對(duì)仲醇類化合物具有非常好的手性選擇性，水溶液中可以將一系列仲醇乙酸酯進(jìn)行較好的拆

4、分，ee值最高可達(dá)到98％。令我們感興趣的是，該酯酶具備一些目前為止所發(fā)現(xiàn)酯酶所不具備的性質(zhì)-非水溶劑中長(zhǎng)時(shí)間保持活性及選擇性。將該酶應(yīng)用于有機(jī)相中的轉(zhuǎn)酯化拆分苯乙醇類化合物中，得到的轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物的ee值最高為＞99%。
　　 (c)然后嘗試由篩選得到的酯酶和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的7種酯酶和脂肪酶應(yīng)用到手性戊二酸單酯類化合物的不對(duì)稱合成中。結(jié)果顯示只有CALB和LipozymTLIM能夠催化該反應(yīng)。通過比較反應(yīng)活性，固定化酶投料量大小及反應(yīng)

5、時(shí)間等因素，最后確定了CALB為該反應(yīng)所使用的生物催化劑。為了減輕工作強(qiáng)度，我們采用了分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)并指導(dǎo)反應(yīng)，結(jié)果顯示分子對(duì)接預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際反應(yīng)結(jié)果較為接近。分子對(duì)接能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)并指導(dǎo)該生物合成是否能進(jìn)行，但是不能預(yù)測(cè)酶的底物構(gòu)型選擇性。
　　 (d)將酯酶和脂肪酶二者聯(lián)合應(yīng)用于手性醇的綠色，連續(xù)拆分中。該方法基于以下策略：將酶能催化轉(zhuǎn)化的異構(gòu)體完全轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的化合物，可以將剩下的另一異構(gòu)體的ee值保持在較高值，然后在C

6、ALB的催化作用下，有機(jī)溶劑中利用NH3作為脫酰試劑對(duì)轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物進(jìn)行氨解（脫酰）反應(yīng)。實(shí)際試驗(yàn)中，未反應(yīng)的醇的ee值可達(dá)到≥98%。經(jīng)過再次的酶選擇性催化，富手性的酯脫?；玫絜e值為≥99%的R構(gòu)型手性醇，即使ee值低于90%的酯經(jīng)過氨解脫?；磻?yīng)后，ee值也得到了大幅提高，可達(dá)到≥99%。實(shí)驗(yàn)中所使用的有機(jī)溶劑，?；w以及固定化酶都能重復(fù)利用。這種綠色脫?；椒ū苊饬耸褂镁彌_溶液水解相應(yīng)的酯而產(chǎn)生的大量廢水和鹽溶液，也避免了化學(xué)脫

7、?；^程中使用大量化學(xué)試劑對(duì)環(huán)境造成污染和異構(gòu)體的消旋化。
　　 (e)根據(jù)本論文相關(guān)章節(jié)中酯酶和脂肪酶可催化的底物及反應(yīng)類型-酯酶和脂肪酶不但能催化其所能接受的傳統(tǒng)的底物及催化類型，還能夠催化一些新的底物及反應(yīng)類型，我們總結(jié)了本論文中涉及的部分酶催化的反應(yīng)，對(duì)酶的模糊性催化性質(zhì)進(jìn)行了初步歸納和論證。最后，總結(jié)了研究底物多樣性的前景及其對(duì)手性化合物的制備具有的積極意義。
　　 (f)根據(jù)本論文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及部分文獻(xiàn)中的報(bào)