紅曲菌的分離鑒定及酯酶特性研究.pdf

1、本論文以26株紅曲菌為供試菌株，在形態(tài)學(xué)鑒定、酯酶同工酶分析的基礎(chǔ)上，對(duì)代表性菌株rDNA ITS、5.8S、18S區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，并對(duì)18S區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE分析，旨在為紅曲菌種的準(zhǔn)確、快速鑒定提供依據(jù)；對(duì)代表性紅曲菌產(chǎn)酯酶條件進(jìn)行優(yōu)化，酯酶經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀、.Sephadex G25層析、聚乙二醇濃縮進(jìn)行初步純化，并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，探討釀酒材料中紅曲菌酯酶的基本性質(zhì)，具有一定的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。主要研究結(jié)果如

2、下：
　　 (1)以分離自醬香型大曲、酒糟、濃香型大曲中的20株紅曲菌、實(shí)驗(yàn)室保存的紅曲菌6株，共26株為供試菌株，根據(jù)李鐘慶和郭芳等的分類方法，通過菌落形態(tài)和顯微特征觀察，初步鑒定出供試菌株中12株為煙色紅曲菌(Monascus fuliginosus)，13株紫色紅曲菌(Monascus pupureus)，1株紅色紅曲菌(Monascus ruber)，共3個(gè)種。
　　 (2)采用優(yōu)化后酯酶同工酶電泳法(NY/T1

3、097-2006)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了25株供試菌株的酯酶同工酶。結(jié)果表明，種間的酯酶同工酶電泳帶型具有多樣性，種內(nèi)菌株間帶型基本一致，與形態(tài)學(xué)鑒定基本吻合。聚類分析結(jié)果顯示，在相似度55％處，25個(gè)菌株分為2個(gè)群，紫色紅曲菌單獨(dú)為一群，煙色紅曲菌、紅色紅曲菌屬同一群。
　　 (3)在形態(tài)學(xué)、酯酶同工酶分析的基礎(chǔ)上篩選出13株代表性菌株，對(duì)rDNA5.8S、ITS、18S進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，并對(duì)18S區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE分

4、析。結(jié)果表明，ITS1區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹將供試菌株分為三類，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果基本吻合；18S區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹將供試菌株分為2類，紫色紅曲菌為一類，煙色紅曲菌與紅色紅曲菌屬同一類；ITS2、5.8S區(qū)只在一定程度上體現(xiàn)菌株間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，不足以用于紅曲菌種間分類；PCR-DGGE分析在譜帶位置及強(qiáng)度基礎(chǔ)上，將供試菌株分為4類，更快速、較準(zhǔn)確地反映出堿基序列的差異。
　　 (4)對(duì)不同來(lái)源的紅曲菌產(chǎn)酯酶活力、酯化酶活力的差異進(jìn)行比較，并對(duì)不同

5、來(lái)源的代表性紅曲菌株產(chǎn)酯酶條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：①不同來(lái)源菌株產(chǎn)胞內(nèi)酶活力均高于胞外酶；分離自醬香型曲的菌株MY8產(chǎn)胞內(nèi)酯酶、胞外酯酶均極顯著(P＜0.01）高于其余菌株，濃香型曲菌株MY10、MY11產(chǎn)胞外酯酶極顯著(P＜0.01）高于其余菌株（除MY8外）；Z1酯化酶活力極顯著(P＜0.01）高于其余供試菌株；②篩選出紅曲菌產(chǎn)胞內(nèi)酯酶最優(yōu)條件為：培養(yǎng)基初始pH5.0、培養(yǎng)溫度32℃、接種量2mL、培養(yǎng)時(shí)間5d。
　　 (5

6、)對(duì)不同來(lái)源的代表性紅曲菌胞內(nèi)、胞外酯酶進(jìn)行初步純化，并對(duì)胞內(nèi)酯酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：①硫酸銨初級(jí)、次級(jí)沉淀最佳飽和度分別為40％，80％;SephadexG25層析上樣量為0.5mL，流速0.5mL.min-1，菌株M5分離得到兩種胞內(nèi)酯酶同工酶，菌株Q5、MY10得到兩種胞外酯酶同工酶，供試菌株經(jīng)Sephadex G25層析純化倍數(shù)，胞外酯酶在6.4～14.1倍，胞內(nèi)酶在5.4～6.5倍。②酯酶最適溫度為35℃，在50℃