2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、紅曲菌(Monascus spp.)是我國傳統(tǒng)的特色發(fā)酵食品紅曲(red yeast rice,redfermented rice)的生產(chǎn)菌株。紅曲是以大米等為原料,經(jīng)紅曲菌發(fā)酵的產(chǎn)物,在我國有一千多年的應(yīng)用歷史,廣泛用做發(fā)酵劑、食品著色劑和中藥配伍?,F(xiàn)代研究表明,紅曲菌還能產(chǎn)生monaclin K、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、色素以及麥角固醇等多種活性成分。目前,國內(nèi)外對(duì)紅曲菌的誘變、代謝產(chǎn)物分離

2、純化及發(fā)酵條件的研究較多,而有關(guān)紅曲菌的分子生物學(xué)研究才剛剛起步。對(duì)紅曲菌產(chǎn)GABA的研究只限于發(fā)酵條件的優(yōu)化。 本研究首先建立了紅曲中GABA的TLC和HPLC分析方法,然后從課題組前期獲得的53株T-DNA插入突變子中篩選得到10株GABA突變子。在此基礎(chǔ)上,采用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)分離到了其中3株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列,并采用RNA干擾(RNA

3、interference,RNAi)對(duì)805<'#>突變子T-DNA插入位點(diǎn)基因cDNA全長(zhǎng)序列的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下: 1.建立了紅曲中GABA的薄層色譜分析法(TLC)。得到薄層色譜法最佳分析條件是以水為提取劑,V<,95%乙醇:V<,25%氨水>=4:1為展開劑,0.2%茚三酮。無水乙醇溶液為顯色劑,在此條件下,GABA最小檢出量為0.2μg。 2.建立了紅曲中GABA反相高效液相色譜熒光分析法(HPL

4、C-FL)。以鄰苯二甲醛(o-Phthalaldehyde,OPA)柱前衍生,色譜條件為:Chromasil C18(5μm,250×4.6 mm)色譜柱;流動(dòng)相:K<,2>HPO<,4>緩沖液(0.1 mol/L,pH 6.0):CH<,3>OH:CH<,3>CN體積比為6:3:1;熒光檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)Ex=340 nm,Em=455nm,流速1.0 mL/min,柱溫35℃。該方法在0.1/μmol/L~100μmol/L濃度范圍內(nèi)

5、線性關(guān)系良好,在此濃度范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率分別為0.48%和95.12%。 3.以TLC結(jié)合HPLC-FL為GABA.的篩選方法,從53株T-DNA插入突變子中篩選出10株產(chǎn)GABA發(fā)生明顯差異的突變子,它們分別是189<'#>、192<'#>、533<'#>、635<'#>、733<'#>、805<'#>、1164<'#>、1263<'#>、3257<'#>和4096<'#>。其中,以1263<'#>制備的紅曲中G

6、ABA含量最高,達(dá)6.184 mg/g,是對(duì)照菌株M-70.436 mg/g的14.2倍。635<'#>的最低,僅為0.156 mg/g,約為M-7的0.33倍。同時(shí)測(cè)定了10株突變子紅曲中桔霉素的含量在0.18μg/g~149.51μg/g儋之間。 4.根據(jù)T-DNA上的Gus基因設(shè)計(jì)引物,對(duì)上述10株GABA突變子進(jìn)行PCR分析,結(jié)果表明它們均含有T-DNA,是T_DNA插入突變子。 5.采用TAIL-PCR對(duì)上述1

7、0株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增,成功獲得了189<'#>、805<'#>和3257<'#>3株突變子T-DNA插入位點(diǎn)的左側(cè)序列。擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度介于500 bp~1300 bp之間。Blast分析發(fā)現(xiàn)突變子805<'#>與煙曲霉(Aspoergillusfumigatus)Af293的發(fā)育調(diào)控子FlbA(fluffy for brlA)中G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)子(regulatorfor G-protein signal

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