紅曲霉產(chǎn)桔霉素相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、紅曲是紅曲霉發(fā)酵大米等淀粉類基質(zhì)的產(chǎn)品，在我國(guó)有上千年的應(yīng)用歷史，并遠(yuǎn)銷日本及歐美各地。然而，1995年法國(guó)Blanc等發(fā)現(xiàn)紅曲中含有真菌毒素桔霉素，從而使紅曲的安全性受到國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注，控制紅曲中桔霉素的含量成為當(dāng)今紅曲的研究熱點(diǎn)之一。本課題以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法建立了紅曲霉T-DNA插入突變體庫(kù)，采用抑菌圈法和HPLC法篩選桔霉素突變子，通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)獲得了T-DNA側(cè)翼未知序列，為進(jìn)一步研究產(chǎn)桔霉素相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

2、主要研究結(jié)果如下： 1．采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化紅色紅曲霉M-7，建立了含有5,000多個(gè)轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化庫(kù)。轉(zhuǎn)化條件如下：紅曲霉于PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)20d，孢子濃度為10<'6>個(gè)／mL，農(nóng)桿菌的濃度OD<,600>為0.5，誘導(dǎo)劑AS濃度為0.8mmolL，農(nóng)桿菌與紅曲霉孢子混合液于30℃共培養(yǎng)3d。 2．轉(zhuǎn)化子接到PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)7d，獲得了40株在菌落顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)速度、氣生菌絲數(shù)量和產(chǎn)孢子能力等方面發(fā)生

3、了顯著變化的突變子。 3．建立了桔霉素的高效液相色譜（HPLC）分析。色譜條件為：chromasil C<,18>（5μm，250×4.6mm）色譜柱，乙腈／水＝50／50流動(dòng)相（用磷酸調(diào)pH2.5），流速1.0 mL／min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量10μL。熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)λex=325nm，λem=512nm。該方法在0.05～50μg／mL范圍對(duì)桔霉素的檢測(cè)有良好線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率分別為1.13％和95.7

4、7％。 4．將PDA上30℃培養(yǎng)6d的紅曲霉菌塊接種于涂有枯草芽孢桿菌的PDA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2d測(cè)量抑菌圈大小。同時(shí)用HPLC檢測(cè)菌塊中桔霉素的含量，發(fā)現(xiàn)抑菌圈的大小與桔霉素含量有一定的關(guān)系，抑菌圈小的轉(zhuǎn)化子桔霉素含量也低，抑菌圈大的轉(zhuǎn)化子桔霉素含量有高有低，這可能和紅曲霉能產(chǎn)生除桔霉素外的其他抑菌物質(zhì)有關(guān)。但是抑菌圈法作為桔霉素突變子的一種初篩方法是可行的。 5．以抑菌圈法為初篩手段，HPLC為復(fù)篩方法，從5,0

5、00多株轉(zhuǎn)化子中挑選出53株桔霉素突變子。將這些突變子制成紅曲后，測(cè)定色價(jià)和桔霉素含量，挑選出8株色素和桔霉素都降低，7株色素和桔霉素都升高，2株色素降低而桔霉素升高，2株色素升高而桔霉素降低共19株突變子進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。 6．根據(jù)T-DNA上的Gus基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR鑒定，表明上述19株突變菌株均有T-DNA插入。根據(jù)T-DNA左端邊界設(shè)計(jì)3條巢式引物，并用7條隨機(jī)兼并引物進(jìn)行了TAIIL-PCR，共獲得了5

6、33<'＃>、635<'＃>、805<'＃>、1164<'＃>、2606<'＃>5個(gè)菌株的T-DNA側(cè)翼序列。將其在NCBI上用blast軟件搜索同源性，發(fā)現(xiàn)805<'＃>與煙曲霉Af293的發(fā)育調(diào)控蛋白FlbA有較高的同源性；1164<'＃>和2606<'＃>的序列均與米曲霉的未知蛋白、構(gòu)巢曲霉FGSCA4的假設(shè)蛋白AN7732.2、煙曲霉Af293的假設(shè)蛋白Afu5g08070有較高的同源性。另外兩個(gè)菌株533<'＃>和635<'＃