紅曲霉桔霉素合成相關(guān)基因的篩選與功能驗(yàn)證.pdf

1、紅曲霉自古是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵菌種，在食品領(lǐng)域應(yīng)用很廣，而紅曲色素也是一種被允許添加到食品中的重要的天然色素。而近些年來，隨著人們對(duì)紅曲霉越來越深入地研究和了解，發(fā)現(xiàn)紅曲霉可以產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，如莫納可琳類物質(zhì)、麥角固醇、β-氨基丁酸、葡糖胺以及各類酶類物質(zhì)。這使得紅曲霉的應(yīng)用領(lǐng)域得到進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大。但是，1995年法國科學(xué)家Blanc等人從紅曲霉產(chǎn)物里分離出了一種真菌毒素，后來證實(shí)為桔霉素。桔霉素會(huì)對(duì)人體的腎臟產(chǎn)生毒害作用。桔霉素的存在

2、，成為紅曲霉產(chǎn)業(yè)的一個(gè)瓶頸，嚴(yán)重影響了紅曲霉產(chǎn)品的生產(chǎn)及出口。為了獲得紅曲霉桔霉素相關(guān)基因，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，成功構(gòu)建了包含927個(gè)突變子的紅曲霉突變庫。經(jīng)過抑菌圈實(shí)驗(yàn)初篩及PCR驗(yàn)證，得到11株桔霉素產(chǎn)量降低的突變株。通過Tail-PCR擴(kuò)增，得到了一株突變子中T-DNA側(cè)翼序列，經(jīng)基因測序以及比對(duì)，其與米曲霉中與烯酮/烯酯還原酶有關(guān)的RIB40基因具有75％的相似度。
　　為了獲得低產(chǎn)桔霉素或不產(chǎn)桔霉素的改造菌株，本

3、研究利用基因敲除技術(shù)對(duì)桔霉素基因簇中的一個(gè)功能基因進(jìn)行了缺失。根據(jù)桔霉素基因簇中開放閱讀框3(ORF3)的上下游序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出1021bp的上游片段和1009bp的下游片段;利用ApaI和XhoI對(duì)上游片段進(jìn)行酶切、SmaI和XbaI對(duì)下游片段進(jìn)行酶切，并與同樣酶切的pUCH2-8載體進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了基因敲除載體，并利用PCR和酶切對(duì)敲除載體進(jìn)行了驗(yàn)證。將敲除載體轉(zhuǎn)入紅曲霉菌株后，利用抗性篩選和PCR驗(yàn)證獲得了一株目標(biāo)基因敲除

4、突變株。對(duì)突變株的色價(jià)和桔霉素產(chǎn)量進(jìn)行檢測檢測，發(fā)現(xiàn)突變株的桔霉素產(chǎn)量降低到野生株的3.52％;與野生株相比，突變株的黃色素產(chǎn)量提高了89.9％，橙色素提高172.1％，紅色素提高140.6％。這一結(jié)果顯示，由于色素的合成與桔霉素的合成需要共同的底物，桔霉素合成途徑的阻斷，導(dǎo)致底物向色素途徑轉(zhuǎn)移，從而提高色價(jià)。
　　本研究通過突變庫篩選獲得了一個(gè)桔霉素合成相關(guān)基因，并利用基因敲除對(duì)桔霉素合成基因簇中的一個(gè)基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，本研