紅曲霉遺傳轉(zhuǎn)化方法研究及色素、桔霉素的研究.pdf

1、紅曲霉的應(yīng)用在我國有著悠久的歷史。如今，紅曲產(chǎn)品廣泛地應(yīng)用在釀酒、食品色素及保健藥品等領(lǐng)域。其中，對紅曲霉在醫(yī)藥保健方面的應(yīng)用的研究近年來已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。但在1995年，紅曲霉中的一種有害代謝產(chǎn)物——桔霉素的發(fā)現(xiàn)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。在歐美各國，桔霉素是食品或飼料中嚴(yán)加控制的毒素之一。 為敲除紅曲桔霉素合成酶編碼基因，構(gòu)建不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉種打下基礎(chǔ)，本課題對紅曲霉原生質(zhì)體的制備方法及紅曲霉9903A的REMI

2、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。重點(diǎn)考察了各種細(xì)胞壁裂解酶和滲透壓穩(wěn)定劑等對紅曲霉原生質(zhì)體形成和再生的影響。將紅曲霉分生孢子在鋪有玻璃紙的平板上32℃培養(yǎng)50-60h收獲的菌絲體最有利于原生質(zhì)體的形成和釋放。紅曲霉菌絲體形成和釋放原生質(zhì)體最適裂解酶和酶解時(shí)間分別為：0.4％lysing enzyme、0.8％cellulase和0.6％snailase的酶組合，31℃作用1.5h；最適滲透壓穩(wěn)定劑是：1mol/L山梨醇。最適合原生

3、質(zhì)體再生的培養(yǎng)基為含0.6mol/L蔗糖的RM2培養(yǎng)基。通過原生質(zhì)體制備方法的研究，可顯著提高原生質(zhì)體的再生率。 本文利用PCR方法從紅曲霉9903A菌株染色體擴(kuò)增出包括ITS1、ITS2的部分序列和5.8S rDNA完整序列的保守系列，通過序列測定及比對分析確認(rèn)該菌種為紫色紅曲霉。用質(zhì)粒pBC-Hygro進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，所建立的轉(zhuǎn)化方法可達(dá)到將外源基因轉(zhuǎn)化到紅曲霉中去的目的。經(jīng)多次轉(zhuǎn)化在潮霉素B抗性平板上共獲得

4、598株轉(zhuǎn)化子，從中挑選色價(jià)與原菌株相當(dāng)和提高的6株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵和穩(wěn)定性的研究。經(jīng)初篩和復(fù)篩，最終獲得了色價(jià)顯著提高的轉(zhuǎn)化子ZM0303。 在進(jìn)行上述原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的同時(shí)，本課題以提高紅曲產(chǎn)品色價(jià)和降低桔霉素含量為目標(biāo)，對紅曲霉的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化進(jìn)行了大量探索性研究。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基組成。還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加適量硫酸鎂、辛酸可以提高發(fā)酵液的色價(jià)并同時(shí)降低桔霉素的含量。在固態(tài)

5、發(fā)酵工藝方面還研究了培養(yǎng)溫度，發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi)(30-36℃)紅曲米的色價(jià)隨著溫度的上升而增加，溫度偏低(30℃)時(shí)，紅曲米桔霉素含量顯著減少。培養(yǎng)過程中較低的加水量有利于紅曲霉產(chǎn)色素。最優(yōu)的固態(tài)發(fā)酵條件是種子發(fā)酵液R3及pH3.5，大米60g，接種量為45％，大米中添加ZnSO<,4> 0.2％、辛酸0.05％，固態(tài)米中加入水pH4.0。在優(yōu)化條件及初始條件下對轉(zhuǎn)化菌株ZM0303進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在整個(gè)發(fā)酵過程中，ZM0303的色價(jià)