食品中桔霉素快速檢測方法的研究.pdf

1、背景：桔霉素又稱桔青霉素,在紅曲產(chǎn)品中的含量較多,紅曲在我國應用有近千年歷史,很早就廣泛用作食品防腐劑、增香劑、發(fā)酵劑,釀酒以及制備紅曲和各種傳統(tǒng)食品.桔霉素是一種真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,具有較明顯的腎毒性,對實驗動物可致畸,劑量過大會導致動物死亡.目前,最常用的桔霉素檢測方法主要為酶聯(lián)免疫吸附分析方法、高效液相色譜法和高效毛細管電泳法等,上述檢測方法均需要復雜的樣品前處理步驟,不僅復雜,耗時長,且難以進行痕量檢測.采用免疫親和層析方法

2、直接對樣品中的桔霉素進行富集凈化,不僅可同時制備、萃取和凈化樣品,且免疫親和柱具有較好的特異性,重現(xiàn)性好,能快速從樣品中分離純化出桔霉素.本研究采用自制的免疫親和柱萃取樣品中的桔霉素,采用具有高效分離能力的高效毛細管電泳法進行分離檢測,建立的快速檢測方法可用于多種食品中桔霉素的常規(guī)檢測與監(jiān)管.
　　目的：采用合成桔霉素免疫原免疫動物,獲得抗桔霉素抗體.采用本體聚合的方法,優(yōu)化條件制備嵌合銅離子(CuII)聚合物作為免疫親和柱填料,

3、將所得抗體偶聯(lián)于聚合物填料制備免疫親和柱,并對兩種紅曲產(chǎn)品中的桔霉素進行富集凈化,同時用高效毛細管電泳的方法進行分離檢測,建立了食品中桔霉素的快速檢測方法.
　　方法：合成桔霉素免疫原,并對其結構進行鑒定,采用合成的免疫原免疫大白兔制備抗桔霉素多克隆抗體.采用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法測定抗血清效價,并進一步采用高效毛細管電泳方法驗證抗血清中含有抗桔霉素的特異性抗體.制備嵌合銅離子聚合物填料,以丙烯酰胺作為功能單體,以二甲基丙

4、烯酸乙二醇酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑,采用本體聚合的方法合成嵌合銅離子聚合物.利用CuII對蛋白質(zhì)分子的螯合力,將抗桔霉素多克隆抗體吸附到嵌合銅離子聚合物的固定相上.然后將吸附了抗體的固定相裝入固相萃取柱里制備免疫親和柱,對洗脫條件進行了優(yōu)化.在此條件下,測定了免疫親和柱吸附容量、添加回收率等性能指標.最后,用高效毛細管電泳的方法檢測樣品中的桔霉素,選擇pH為9.28的20 mmol/L的硼砂緩沖液,運行電壓為20 kV,紫外檢測波長為

5、319 nm,毛細管柱溫為25℃.毛細管的有效長度為45 cm,毛細管的內(nèi)徑為75μm,對其分離分析條件進行了進一步優(yōu)化.
　　結果：對合成針對桔霉素抗原中載體蛋白與桔霉素的物質(zhì)的量之比進行紫外測定,桔霉素與BSA物質(zhì)的量之比是26.38:1,桔霉素與OVA的物質(zhì)的量之比是17.58:1.采用桔霉素和BSA的偶聯(lián)物為免疫原免疫大白兔,分析了抗體的產(chǎn)生進程與效價.1號和2號大白兔分別從第35天和第49天開始有明顯抗體產(chǎn)生,約在第77

6、天抗體含量達到最高峰,3號大白兔一直沒有較明顯的抗體產(chǎn)生.1號、2號和3號大白兔的抗血清效價分別是:1:135000、1:16000和1:4000.優(yōu)化選擇了制備嵌合銅離子聚合物的合成條件,在水溶液環(huán)境下,選擇的醋酸銅含量是30 mg,聚合物吸附抗體時間為10 h,測得聚合物對抗體的最大吸附量是196 mg/g,選用pH為7,濃度為60％的甲醇,抗體能夠較好地吸附到CuII聚合物上.采用高效毛細管電泳方法測定紅曲產(chǎn)品中的桔霉素,通過研究

7、洗脫液的種類、濃度和pH等因素對分離結果的影響,選用80％的甲醇溶液作為提取劑,采用PBS緩沖液洗滌,60％的甲醇溶液洗脫,可以將免疫親和柱中結合的桔霉素完全洗脫下來,并且不會影響CuII聚合物上所連抗體的穩(wěn)定性。測得免疫親和柱對桔霉素的最大吸附能力約為597 ng,通過實驗檢測,在50～150μg/kg濃度范圍內(nèi),紅曲紅和紅曲米中樣品桔霉素回收率為83.7％～93.2％,相對標準偏差為0.84％～2.06％.
　　結論：本研究通