食品中赭曲霉毒素污染的免疫學(xué)快速檢測(cè)方法研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展，人們的生活水平的提高，食品衛(wèi)生與安全已經(jīng)成為人們普遍關(guān)注的話題。但是近年來(lái)，由各種食品安全因子導(dǎo)致的食品安全事件層出不窮，給民眾帶來(lái)了恐慌，因此，為維護(hù)食品安全及民眾健康，建立食品安全因子的快速、高效檢測(cè)技術(shù)意義重大。赭曲霉毒素是一種有毒真菌代謝產(chǎn)物，對(duì)動(dòng)物和人類具有腎臟毒、肝毒、致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用。本研究以污染農(nóng)產(chǎn)品的赭曲霉毒素為檢測(cè)對(duì)象，分別構(gòu)建了酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、納米金免疫層析試紙條產(chǎn)

2、品，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)產(chǎn)品中赭曲霉毒素的快速檢測(cè)。本論文研究成果如下:
　　1、抗赭曲霉毒素單克隆抗體的制備、純化及免疫學(xué)鑒定:以O(shè)TA-BSA為免疫原免疫6周齡的Balb/c健康雌性小鼠，第四次免疫完成后尾部取血，測(cè)定血清的效價(jià)以及親和力，選擇具有較高親和力血清的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。本實(shí)驗(yàn)以液體培養(yǎng)基法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，經(jīng)ELISA方法，最終篩選出8株分泌抗赭曲霉毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株:11B

3、9、11D2、11G6、11C5、1E2、11F5、11A9、11E10，這8株細(xì)胞所誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹水靈敏度（以IC50表示）分別為0.52ng/mL、0.68 ng/mL、1.30 ng/mL、1.08 ng/mL、45.79 ng/mL、1.25 ng/mL、1.50 ng/mL、1.27 ng/mL，所篩選出的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體對(duì)其他真菌毒素沒(méi)有抑制作用，具有較強(qiáng)的特異性。
　　2、赭曲霉毒素A檢測(cè)ELISA試劑盒的研制

4、及其特性鑒定:以抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體為基礎(chǔ)，建立了簡(jiǎn)單、靈敏、高效的赭曲霉毒素A檢測(cè)ELISA方法，通過(guò)棋盤(pán)滴定法確定抗原OTA-BSA最佳包被濃度為2μg/mL，抗體稀釋8000倍，酶標(biāo)二抗稀釋5000倍，在此條件下對(duì)ELISA的各個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化。在最佳條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程:y=-0.3613x+0.3411;R2=0.9576，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線確定IC50為0.22 ng/mL。試劑盒檢測(cè)批內(nèi)變異系數(shù)(C

5、V)平均值為3.62％，批間CV平均值為3.74％，具有較高的精確度。使用該檢測(cè)方法分別對(duì)黃豆、花生、玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)得的樣品回收率均在90％以上，表明該試劑盒可用于農(nóng)產(chǎn)品中赭曲霉毒素的檢測(cè)。
　　3、主要赭曲霉毒素快速檢測(cè)免疫層析試紙條的構(gòu)建及特性鑒定:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了食品中三種主要赭曲霉毒素的快速檢測(cè)免疫層析方法，并研制了相應(yīng)的試紙條產(chǎn)品。以檸檬酸還原氯金酸，制備了顆粒大小為15nm的納米金顆粒，作為信號(hào)標(biāo)記材料。

6、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終該免疫層析試紙條對(duì)OTA、OTB、OTC的檢測(cè)限分別為0.05 ng/mL、0.025 ng/mL、0.1 ng/mL，消線濃度為0.5 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL。該試紙條對(duì)其他結(jié)構(gòu)類似真菌毒素沒(méi)有抑制作用，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，在干燥條件下4℃可保存六個(gè)月。在玉米、花生、燕麥樣品中對(duì)OTA、OTB、OTC的檢出限分別為0.2μg/kg、0.1μg/kg、0.4μg/kg，該靈敏度遠(yuǎn)低于