根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉轉(zhuǎn)化庫(kù)的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子性質(zhì)研究.pdf

1、紅曲霉(Monasucsruber)是我國(guó)重要的微生物資源，能產(chǎn)生許多有用物質(zhì)，如紅曲色素、莫吶可啉類物質(zhì)、酶和γ-氨基丁酸等。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅曲霉代謝產(chǎn)物和發(fā)酵條件的研究很多，但是對(duì)紅曲霉分子生物學(xué)方面的研究還比較少。該課題建立了以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化紅曲霉的方法，并初步研究了轉(zhuǎn)化子的性質(zhì)，為紅曲霉分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.對(duì)影響轉(zhuǎn)化率的一些因素進(jìn)行

2、了優(yōu)化，這些因素包括：紅曲霉培養(yǎng)基種類、紅曲霉培養(yǎng)時(shí)間、紅曲霉孢子濃度、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮(AS)的濃度、D-半乳糖和AS聯(lián)合使用的作用、根癌農(nóng)桿菌濃度、共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時(shí)間。通過(guò)優(yōu)化建立了農(nóng)桿菌的高效轉(zhuǎn)化體系為：用PDA培養(yǎng)紅曲霉20d后收集其孢子，孢子濃度為106/ml，誘導(dǎo)劑AS的濃度為80mmol/L，根癌農(nóng)桿菌的濃度OD600為0.5，根癌農(nóng)桿菌和紅曲霉孢子于30℃共培養(yǎng)3d。采用此轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建了含有5,100多個(gè)轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化

3、庫(kù)。 2.提取1～10號(hào)轉(zhuǎn)化子的DNA，根據(jù)T-DNA上已知Gus基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR。結(jié)果證明轉(zhuǎn)化子含有插入的T-DNA片段。 3.對(duì)轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。隨機(jī)挑選14株轉(zhuǎn)化子，在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上分別傳代6次；同時(shí)，將轉(zhuǎn)化子7號(hào)和9號(hào)的孢子適當(dāng)稀釋后分別涂布在PDA和含50mg/L潮霉素的PDA上傳代4次，觀察菌落形態(tài)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子在遺傳上基本是穩(wěn)定的。 4.將5,100

4、多個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于PDA上，30℃培養(yǎng)14～30d，觀察并篩選菌落形態(tài)和顯微特征變異明顯的轉(zhuǎn)化子。結(jié)果得到32株菌落顏色、氣生菌絲、菌落隆起和生長(zhǎng)速度都和出發(fā)菌株有明顯差異的轉(zhuǎn)化子。其中16株的顯微形態(tài)有較大變異，這些變異包括：閉囊殼壁的厚度、分生孢子的形狀、菌絲表面顆粒形狀等。 5.隨機(jī)挑選7株變異轉(zhuǎn)化子，分別接種于米飯培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)14d后，測(cè)了它們的色價(jià)，并采用紫外可見掃描分析了其色素組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與原始菌株相比，7株轉(zhuǎn)