食品中大腸菌群的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

1、大腸菌群的概念,◆大腸菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。◆包括埃希氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬,測(cè)定意義,◆大腸菌群作為糞便污染指示菌。即在食品中檢出大腸菌群，不僅反映食品被糞便污染總的情況，一定程度上也反映了食品在生產(chǎn)加工、運(yùn)輸、保存等過程中的衛(wèi)生狀況，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義?！舴彩谴竽c菌群數(shù)超過規(guī)定限量的食品，即可確定其衛(wèi)生學(xué)上是

2、不合格的，該食品使用是不安全的。,大腸菌群數(shù)量的表示方法--MPN,MPN: Most Probable Number(大腸菌群最可能數(shù)) ◆ 是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理所測(cè)定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值。,◆三管系列：對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)10倍梯度系列稀釋，選擇3個(gè)連續(xù)的合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，查取大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表，報(bào)告每100mL(g)檢樣大腸菌群的最近

3、似數(shù)。,大腸菌群MPN的檢驗(yàn)方法--多管發(fā)酵法,大腸菌群的檢驗(yàn)程序,過程,◆檢樣稀釋◆乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)（假定試驗(yàn)）◆分離培養(yǎng)◆乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）◆報(bào)告,檢樣稀釋,1. 檢樣25mL(25g)放于含有225mL無菌生理鹽水的三角瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣用無菌均質(zhì)器。以8000-10000r/min的速度處理1min，做成 1:10的均勻稀釋液；,檢樣稀釋,2. 用1mL無菌吸管吸取1:10稀釋液1m

4、L，注入含有9mL無菌生理鹽水的試管內(nèi)，振蕩混勻，作1:100的稀釋液；3. 另取1mL無菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液，每稀釋一次換用 1支1mL無菌吸管；,檢樣稀釋,4. 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況估計(jì)，選3個(gè)稀釋度，每稀釋度接種3管。 每100mL消毒乳中大腸菌群MPN不超過40個(gè),乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)（假定試驗(yàn)）,◆目的：檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌?！魧⒋龣z樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi);◆乳糖：

5、選擇作用，大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣;◆膽鹽：抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌；◆溴甲酚紫：pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色，溴甲酚紫還有抑制其他細(xì)菌如芽孢桿菌生長(zhǎng)的作用。,乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)（假定試驗(yàn)）,◆接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管；◆每一稀釋度接種3管，置(36±1)℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)(24±2)h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)

6、告為大腸菌群陰性?！羧绠a(chǎn)氣，按另外程序進(jìn)行。,大腸菌群陽性反應(yīng),,乳糖膽鹽發(fā)酵管,產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象,分離培養(yǎng),◆將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管培養(yǎng)物分別劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h，挑取典型的菌落，并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。,分離培養(yǎng),◆伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMB）：伊紅和美藍(lán)染料作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，這兩種染料結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生特征性菌落：◆a 深紫黑色，有金屬

7、光澤；◆b 紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；◆c 淡紫紅色、中心顏色較深。,,伊紅美藍(lán)瓊脂平板,特征性菌落,乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）,◆目的：證明從乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。,乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）,◆在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-3個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置(36±1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)(24±2)h，觀察產(chǎn)氣情況。,乳糖復(fù)發(fā)酵

8、試驗(yàn)（證實(shí)試驗(yàn)）,◆作用機(jī)理同乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)◆凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸菌群陽性；◆凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色陽性，即報(bào)告為大腸菌群陰性。,報(bào)告,◆根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN的檢索表，報(bào)告每100mL(g)食品中大腸菌群的最可能數(shù)(MPN)。,大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表,大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表（續(xù)）,說明,◆本表采用3個(gè)稀釋度：1mL(g) 、0.1mL(g) 0.0

9、1mL(g)，每稀釋度3管；◆表內(nèi)所列檢樣量如改用10mL(g) 、1mL(g)、0.1mL(g)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；◆如改用0.1mL(g) 、0.01mL(g) 0.001mL(g)，表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)增加10倍；◆依此類推。,實(shí)驗(yàn)樣品及要求,◆檢測(cè)食品：純奶◆稀釋度：1:1、1:10、1:100稀釋液,結(jié)論,◆ 加入純奶1:1、1:10、1:100稀釋液的乳糖膽鹽發(fā)酵管陽性管數(shù)分別為0、1、1，查大腸菌群MPN檢索表◆