實(shí)驗(yàn)九水中總大腸菌群的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)九 水中總大腸菌群的測(cè)定,一 實(shí)驗(yàn)器材1 培養(yǎng)基乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管）培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂平板2 溶液和試劑革蘭氏染色液3 儀器和其他用品高壓濕熱滅菌器、顯微鏡、載玻片、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌吸管、試管、三角瓶、接種環(huán)二 目的要求1 學(xué)習(xí)檢測(cè)水中總大腸菌群的方法。2 了解檢測(cè)水中總大腸菌群各種方法的原理及其應(yīng)用中的優(yōu)、缺點(diǎn)。3 了解水質(zhì)評(píng)價(jià)的微生物學(xué)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，明白其應(yīng)用的重要性。,實(shí)驗(yàn)八 水中總大

2、腸菌群的測(cè)定,三 基本原理 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。 多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過(guò)三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以

3、最可能數(shù)簡(jiǎn)稱MPN表示。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（most probable number, MPN)表示。,四 培養(yǎng)基的配制（1）乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按照說(shuō)明稱取適量培養(yǎng)基，溶于蒸餾水中，分裝于試管中，每個(gè)試管10ml，倒置一德漢氏小管，于115℃高壓滅菌器中滅菌20min，貯存于冷暗處備用。（2） 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述制備方法配制，除蒸餾水外，培養(yǎng)基用量增加至三倍，分裝于試管中，每個(gè)試

4、管5ml 。（3） 伊紅美培養(yǎng)基：按照說(shuō)明稱取適量培養(yǎng)基，置于三角瓶中，加蒸餾水溶解， 115℃高壓滅菌15min，待冷卻至45℃—50℃ ，倒平板待用。,培養(yǎng)基配制操作圖示：,用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面,培養(yǎng)基的分裝：一般制作斜面培養(yǎng)基時(shí)，每只15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般以其容積的一半為

5、宜。,◆包扎1．培養(yǎng)皿：以舊報(bào)紙密密包緊，一般以6套做一包，待滅菌。2．吸管：在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段1.5cm長(zhǎng)的棉花。棉花要塞得松緊恰當(dāng)（過(guò)緊，吹吸液體太費(fèi)勁；過(guò)松，吹氣時(shí)棉花會(huì)下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報(bào)紙條的的近左端，與報(bào)紙約呈60º角，并將右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。3．三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報(bào)紙條的近左端，與報(bào)紙約呈45º角，并將右端多余的報(bào)紙打一小結(jié)。4

6、. 玻璃器皿、金屬器械包扎完畢后置干燥箱160－170℃滅菌2 h.,1.滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將用防水紙包扎好的物品放入其中。 2.接通電源，進(jìn)行加熱。 3. 排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開(kāi)，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)再打開(kāi)排氣閥，待壓力回復(fù)到0時(shí)再

7、關(guān)閉排氣閥。 4.當(dāng)壓力達(dá)15bl/in2（即1.05kg/cm2）時(shí)，此時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度為1210C，維持30min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長(zhǎng)時(shí)間。

8、 5.滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥，然后打開(kāi)滅菌器蓋，取出物品。,◆滅菌,高壓蒸汽自動(dòng)滅菌鍋,手提式高壓蒸汽滅菌鍋,倒平板操作法示意圖,斜面擺放與冷凝,五 操作步驟1 水樣的采?。?）檢測(cè)自來(lái)水 先將自來(lái)水龍頭用火焰燒灼3 min滅菌，再開(kāi)放水龍頭使水流5 mi

9、n后，在火焰旁打開(kāi)滅菌三角瓶塞，以其接取水樣，迅速地進(jìn)行分析。 （2）檢測(cè)池水、河水或湖水 應(yīng)取距水面10－15cm的深層水樣，先將滅菌帶玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，撥開(kāi)玻璃塞，水即流入瓶中，滿后將玻璃塞塞好，再?gòu)乃腥〕觥Ｓ袝r(shí)需用特制的采樣器取水樣。采取的水樣最好立即檢測(cè)，否則需放入冰箱中保存。,3 初發(fā)酵試驗(yàn) （1）生活飲用水 在兩個(gè)裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管

10、），以無(wú)菌操作各加入已充分混勻的水樣100mL。在10支裝有已滅菌的5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無(wú)菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 （2）水源水在裝有5ml 3倍濃度濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中加入10ml水樣品；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL水樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分別加

11、入1mL 1：10稀釋的水樣。共計(jì)15管，三個(gè)稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h。 （可以根據(jù)水的污染程度選擇3個(gè)稀釋度）,4 分離培養(yǎng) 將初發(fā)酵的陽(yáng)性管(產(chǎn)酸產(chǎn)氣)的菌液分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板。置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)。選擇符合大腸菌群菌落特征的菌落:① 深紫黑色，有金屬光澤；② 紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；③ 淡紫紅色，中心顏色較深, 挑取一部

12、分，進(jìn)行革蘭氏染色。,平板劃線分離操作法示意圖,5 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒置管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管的最典型菌落1～3個(gè)，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表”，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。每組：三倍濃縮

13、乳糖蛋白胨（5 ml）15管 普通濃度乳糖蛋白胨（10 ml）15管伊紅美蘭培養(yǎng)基 150 ml (5個(gè)平板)三角瓶1個(gè)（裝27mL蒸餾水滅菌）、 10ml吸管 2支、1ml吸管2支包扎滅菌,表2 最可能數(shù)(MPN)表,（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時(shí)，不同陽(yáng)性及陰 性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）,思考題,1. 何謂大腸菌群？它主要包括哪些細(xì)菌屬？2. 假如水中有大量致病